lncRNA与癌症发展联系大揭秘——UCA1与胃癌
栏目:最新研究动态 发布时间:2019-07-15
UCA1是一种已被发现的lncRNA,研究者们发现它多种癌细胞的迁移、侵袭和耐药密不可分......

lncRNA在多种细胞过程中发挥着重要的作用,近年来,关于lncRNA的研究已逐渐成为一个热门项目。UCA1是一种已被发现的lncRNA,研究者们发现它多种癌细胞的迁移、侵袭和耐药密不可分。今年7月,Dr. Wang CJ等人在杂志《molecular cancer》上发表了一篇题为“The lncRNA UCA1 promotes proliferation, migration, immune escape and inhibits apoptosis in gastric cancer by sponging anti-tumor miRNAs”的文章,探究了长链非编码RNA UCA1在胃癌发生发展过程中所扮演的角色,揭露了UCA1促进胃癌细胞增殖、迁移、免疫逃逸的机制,为治疗胃癌提供了新的思路

摘要:

背景:UCA1是一类长链非编码RNA,在胃癌(GC)等多种人类肿瘤中均被发现存在过表达现象。目前认为UCA1能够促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭,但UCA1在整个免疫逃逸过程中的作用尚不清楚。

方法:我们收集了40对胃癌和非肿瘤组织样本。采用原位杂交和qRT-PCR法测定 UCA1在胃癌和对照组织中的表达水平。采用MTT法测定细胞活力。使用transwell法检测GC细胞的迁移能力。为了了解UCA1在免疫逃逸过程中的作用,野生型或UCA1 KO GC细胞与外周血单核细胞或细胞因子诱导的杀伤细胞在体外共培养。用小鼠模型检测UCA1在体内的功能。

结果:UCA1促进GC细胞增殖和迁移,并抑制细胞凋亡。UCA1通过直接作用抑制miR-26a/b,miR-193a和miR-214的表达,进而上调PDL1的表达。当与外周血单核细胞(PBMCs)共培养时,UCA1-KO GC细胞可以诱导更高的IFNγ表达,当在体外与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共培养时存活率较低。UCA1-KO GC细胞形成较小的肿瘤,miR-26a、- 26b、- 193a和- 214水平较高,异种移植小鼠模型细胞增殖减少,凋亡增加。

结论:UCA1过表达保护PDL1表达不受miRNAs的抑制,促进GC细胞的免疫逃逸。UCA1可作为一种潜在的新型GC治疗靶点。UCA1(尿路上皮癌相关1)是一种最早在人类膀胱癌中被发现的lncRNA,在许多其他癌症中发现其表达上调,参与癌细胞的迁移、侵袭和耐药。

技术路线:

研究者的实验思路大致如下:

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结果:

一、GC患者体内UCA1升高,且与肠型GC患者预后不良有关

研究者首先利用两个已发表的芯片GSE54129(111例胃癌患者和21例对照组)和GSE65801(32对胃癌和非癌组织)分析了UCA1在胃癌组织和非癌对照组织中的表达。然后收集了40对胃癌和非癌组织样本(21例肠型,13例弥漫型,7例混合型),用qRTPCR检测UCA1水平。为进一步证实UCA1在GC组织中的上调并确定其亚细胞位置,研究者使用原位杂交(ISH)检测UCA1在 GC和对照组织切片中的表达。最后,研究者分析Dr. Szász AM等人报道的数据(320例肠型GC, 241例弥漫型GC, 32例混合型GC),发现UCA1水平较高的肠型GC患者总体生存率较低,这说明UCA1在胃癌发生过程中具有潜在的致癌作用。

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Fig. 1 在GC组织中发现UCA1调解异常,与预后不良有关。a 用T检验对两个芯片(GSE54129和GSE65801)的UCA1水平进行分析。P < 0.05为差异有统计学意义。 B采用qPCR法检测40对胃腺癌及相应的邻近非肿瘤性胃组织的UCA1水平。结果按照Lauren分类显示,采用单因素方差分析法分析。**p < 0.01。 c 具有代表性的原位杂交图像显示UCA1在GC和对照组织中的表达。用图像J量化UCA1信号的相对密度,用T检验确定其显著性。比例尺,100 μM。 d 采用Kaplan-Meier分析320例肠型GC、241例弥漫型GC和32例混合型GC的生存数据进行分析,p < 0.05为差异有统计学意义

二、UCA1是一类促进胃癌细胞增殖、迁移并抑制凋亡的致癌基因

为探讨UCA1在GC细胞中的生物学功能,研究者构建了UCA1过表达载体,建立了UCA1过表达GC细胞系。同时构建UCA1敲除载体,该载体表达两个针对UCA1启动子区域的向导RNA,构建UCA1敲除细胞系。

研究者利用MTT检测细胞的存活率,用流失细胞术检测细胞凋亡,由利用transwell检测细胞的迁移能力。

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Fig. 2 UCA1是一种onco-lncRNA,能够促进GC细胞的增殖、迁移并抑制细胞凋亡。a成功建立UCA1过表达GC细胞。b 采用MTT法测定UCA1过表达细胞和对照组GC细胞的存活率。c 原理图为UCA1敲除载体设计。以UCA1启动子区为靶点的两个向导RNA通过一个质粒共表达。d 通过共转染UCA1-KD载体和Cas9表达载体,成功降低了两种GC细胞的UCA1水平。e MTT法测定UCA1-KD GC细胞的存活率。f 细胞凋亡检测。用FITC标记的Annexin V抗体孵育UCA1-KD或对照GC细胞,然后PI染色。流式细胞术测定细胞凋亡率。g和h细胞过夜,消耗血清,用丝裂霉素处理,然后进入Transwell的上腔室。用4%多聚甲醛固定迁移到下腔室的细胞,然后用结晶紫染色。使用倒置显微镜,在5个随机不同视野中对结晶紫染色细胞计数。结果用t检验进行分析,p < 0.05为差异有统计学意义。 *p < 0.05, **p < 0.01
三、UCA1与miR-26a/b相互作用,调控EZH2和CDK6的表达。
      近年来的许多报道指出,lncRNA可以对各种miRNA产生“海绵样”作用,从而抑制由miRNA介导的功能。研究者分析发现miR-26a和-b可以直接与UCA1结合并用双荧光素酶验证,除了检测UCA1在GC细胞中过表达时,内源性miR-26a和-b的表达水平变化外,研究者还检测了miR-26靶蛋白EZH2和CDK6的蛋白水平,随后,研究者用qRT-PCR测定体内miR-26a和-b水平。结果证明,UCA1通过海绵作用吸附miR-26a/b以调控EZH2和CDK6的表达。

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Fig. 3 UCA1海绵作用吸附miR-26a/b,从而促进miR-26a/b靶基因的表达。a 预测miR-26a/b与UCA1之间的相互作用。 b 双荧光素酶检测。用UCA1 3'UTR报告载体和miR-26a/b模拟物或抑制剂转染HEK293T细胞。相互作用48小时后检测相对荧光素酶活性。c和d 过表达UCA1的GC细胞中miR-26a和-b水平受到抑制,miR-26a和-b靶基因表达上调。 e 采用qRTPCR法检测40对胃癌及相邻非肿瘤对照标本中miR-26a和-b的水平。通过相关分析,分析UCA1与miR-26a或-b的相关性。

四、UCA1直接与miR-214和miR-193a相互作用

研究者发现发现miR-214和-193有被UCA1“海绵”吸附的潜力,此前有报道称此二者均具有抑制肿瘤的功能。研究者采用双荧光素酶法测定miRNA与UCA1的相互作用。

      PDL1可以与PD-1相互作用,抑制T细胞活化,诱导效应T细胞凋亡,最终削弱抗肿瘤免疫。研究者通过预测发现在PDL1 Mrna的3’UTR上存在miR-214和-193a靶点。随后研究者采用双荧光素酶法测定miRNA与PDL1的相互作用。

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Fig. 4 UCA1与miR-193a和miR-214相互作用,然后调节PDL1的表达。a 预测UCA1与miR-193a或miR-214之间的相互作用。b 双荧光素酶检测。用UCA1全序列作为萤火虫荧光素酶3'UTR的报告载体,与HEK293T细胞共转染,并加入miRNA模拟物或抑制剂。转染48小时后检测荧光素酶活性。 c qRT-PCR检测miR-193a和- 214的相对表达。d 预测PDL1与miR-193a或miR-214之间的相互作用。e 双荧光素酶检测。将HEK293T细胞与PDL1 3'UTR报告载体和miR-193a或miR-214的模拟物或抑制剂共转染48h。检测荧光素酶活性,用t检验分析结果。 f miR-193a和miR-214抑制内源性PDL1表达

五、UCA1通过海绵miR- 214和miR-193a调控PDL1表达

研究者通过western blot和流式细胞术分析了UCA1敲除后GC细胞中PDL1表达,以确定UCA1敲除是否可以通过海绵miRNA诱导GC细胞中PDL1下调进而减轻T细胞的抑制,同时使用拮抗剂进行挽救,以验证结论。由实验结果可以看出,细胞表面PDL1水平受UCA1-miR-193a/214轴调控。

研究者通过检测释放到上清液中的IFNγ水平评估如果调控GC细胞株上PDL1的表达是否可以改变受PHA刺激的健康供体PBMC的活化。

研究者还分析了在效应靶比为10:1至40:1的范围内,CIK细胞对AGS和SGC-7901细胞的细胞毒性。

 

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Fig. 5 敲除UCA1可恢复受PHA刺激的T细胞活化,提高CIK治疗的细胞毒性。a UCA1-KD GC细胞中总PDL1水平降低。b 流式细胞术检测细胞表面PDL1。c PHA诱导的PBMCs与UCA1-KD或对照组GC细胞共培养。ELISA检测上清液中产生的IFNγ。d 降低GC细胞中PDL1的表达可以提高对体外CIK治疗的细胞毒性敏感性

六、UCA1调控PDL1表达,调节抗肿瘤免疫反应

为了探讨UCA1敲除在体内肿瘤生长调控中的作用,研究者利用AGS细胞皮下异种移植小鼠模型检测UCA1的功能。将AGS-NC和AGSUCA1-KO细胞皮下注射到SCID小鼠体内。每7天测一次肿瘤体积,连续28天。

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Fig. 6 UCA1表达的下调抑制了异种移植小鼠模型肿瘤的生长。a 我们利用AGS细胞株研究了UCA1下调对胃癌皮下移植小鼠模型调控的影响。将AGS-NC和AGS-UCA1-KD细胞皮下注射到SCID小鼠体内。每周测量肿瘤体积,连续4周。b 统计分析显示, PDL1表达下调显著抑制肿瘤生长。c 28天后,UCA1-KD组肿瘤重量较对照组轻(p < 0.001)。d qRT-PCR结果显示,UCA1-KD组miR-26a、miR-26b、miR-193a、miR-214水平升高。e 免疫组化结果显示,UCA1-KD组的PDL1蛋白水平和Ki-67表达均下降。f 免疫印迹结果显示,UCA1-KD肿瘤中裂解的PARP1和caspase-3表达水平升高

结论:

UCA1可以通过抑制miR-26a和miR-26a等抗肿瘤miRNA的表达,促进胃癌细胞的增殖迁移,并抑制细胞凋亡;抑制miR-193a和miR-214等miRNA的表达,使PDL1表达上调,从而抑制宿主免疫系统的功能。UCA1-KO GC细胞在体内形成较小的肿瘤,miR-26a、- 26b、- 193a、- 214水平较高,细胞增殖减少,凋亡增加。

这些研究证明,UCA1与GC的发生发展关系甚密,可以以其为新的切入点, 探究GC治疗的新靶点。