肺癌治疗的手段-AIF

凋亡诱导因子（AIF）不仅参与细胞凋亡，还在线粒体内发挥重要的功能，它通过线粒体呼吸链中复合物I的转录后调控，决定氧化磷酸化(OXPHOS)的速率。近些年，AIF被广泛研究。今天小编就带大家了解关于AIF调控氧化磷酸化支持肺癌的发展的文章AIF-regulated oxidative phosphorylation supports lung cancer development。

在本研究中，作者使用Kras^G12D驱动的小鼠肺癌模型，通过AIF敲减、线粒体呼吸评估、糖酵解、WT或线粒体锚定的AIF重新表达和和肺癌转录组数据分析证明了AIF调控线粒体呼吸和OXPHOS，从而促进肺癌的进展。
结果:
1）减少AIF缺乏Kras^G12D小鼠的肺癌
为了确定AIF在肺癌中的作用，我们将AIF ^fl/fl 小鼠与Lox-Stop-Lox-Kras^G12D菌株杂交。Lox-Stop-Lox-Kras^G12D小鼠在Cre缺失并诱导突变的Kras^G12D等位基因后，逐步发展为非小细胞肺癌（NSCLCs），从上皮细胞增生到良性腺瘤和恶性腺癌。与对照组相比，Kras^G12D驱动的肺癌模型中AIF的缺失显著延长了存活时间（图1a）。在所有时间点分析中，与对照相比，Aif^{fl / y} Kras^G12D小鼠肺中肿瘤区域的数量减少(图1 b， c)。这些结果表明，AIF基因失活可显著降低krasg12d驱动的肺癌发生。接下来我们评估了肿瘤的发生和肺癌的恶性进展。Ad5-CMV-Cre吸入4周后，微CT显示Aif^fl/y Kras^G12D小鼠肿瘤病灶明显减少，且在整个观察期间均观察到肿瘤病灶减少（图1d）。

2）AIF的缺失会损害OXPHOS并破坏线粒体结构
由于AIF影响肿瘤的发生和早期发展，我们从Aif^fl/y Kras^G12D和AIF^+/y Kras^G12D胎鼠中分离出原代肺细胞，随后用Ad5-CMV-Cre-eGFP感染培养细胞，激活Kras^G12D表达，同时删除AIF（图2a）。正如之前研究中所预期的那样，AIF的缺失也导致线粒体复合物I蛋白的减少（图2a）。然后分析AIF突变原代肺细胞的耗氧量（OCR），以评估线粒体呼吸。Aif^fl/y Kras^G12D细胞在较低的基础水平上消耗氧气，产生更少的ATP，并且在对FCCP的响应中表现出有限的OCR增加，导致最大呼吸容量降低（图2 b，c）。
在体内Ad5-CMV-Cre感染6周后，我们从Aif^fl/y Kras^G12D和Aif^+/y Kras^G12D胎鼠中分离出原代转化的肺细胞。值得注意的是，小鼠感染的病毒滴度是正常浓度的5倍，以确保大多数肺细胞被感染（图2d）。与我们的短期培养相似，体内Ad5- CMV-Cre处理导致基础呼吸、ATP生成、最大呼吸和备用呼吸能力减少（图2e）。我们还对Ad5-CMV-Cre吸入16周后Aif^fl/y Kras^G12D和Aif^+/y Kras^G12D小鼠新分离肿瘤组织中的线粒体进行了表征。具有AIF活性的肿瘤细胞与缺乏AIF的肿瘤细胞线粒体数量无明显差异；然而，Aif^fl/y Kras^G12D肿瘤细胞线粒体肿胀，嵴结构明显减少，排列紊乱（图2f）。因此，AIF的缺失不仅会导致OXPHOS的普遍受损，还会导致线粒体形态异常。

3）AIF缺乏增强糖酵解和对葡萄糖缺乏的敏感性
在添加葡萄糖刺激糖酵解后，Aif^fl/y Kras^G12D肺细胞的基础细胞外酸化率高于Aif^+/y Kras^G12D对照细胞（图3a）。添加寡霉素后，通过OXPHOS抑制ATP产生，Aif^fl/y Kras^G12D细胞和Aif^+/y Kras^G12D细胞的糖酵解活性均增加，但Aif^+/y Kras^G12D细胞的糖酵解活性明显增加（图3 b）。在体外Ad5-mSPC-Cre处理的Aif^fl/y Kras^G12D肺细胞中，糖酵解也增加了（图3 c，d）。对照Aif^+/y Kras^G12D细胞不受2-DG 72 h孵育的影响，，而Aif^fl/y Kras^G12D细胞死亡率增加（图3e）。同样，葡萄糖缺乏对Aif^+/y Kras^G12D细胞无明显影响，但影响Aif^fl/y Kras^G12D细胞的生长（图3f）。最后，我们观察到在葡萄糖缺乏条件下培养的Aiffl/yKrasG12D肺细胞内ATP水平显著下降（图3g）。这些结果表明AIF的缺失导致OXPHOS缺乏症和细胞代谢向糖酵解的转变。Aif^fl/y Kras^G12D肺细胞中，OXPHOS对ATP合成的贡献较小，主要由糖酵解提供，而Aif^+/y Kras^G12D细胞中的ATP大部分由OXPHOS生成。

4）稳定的AIF缺失会损害KRAS WT和KRAS突变的肺癌细胞的克隆潜能和增殖
在KRAS突变的NSCLC A549细胞中，AIF的稳定下调抑制了CHCHD4的表达，并导致呼吸链蛋白如CIII-UQCRC2、cii - coxii和CI-NDUFB8的减少以及OXPHOS、ATP生成、克隆潜能和增殖的减少。另外，AIF敲除显著降低了H1437、H727、A427、H1650、H358以及A549细胞的克隆能力（图5）。

5）重新表达WT或线粒体锚定的AIF可恢复肺癌敏感性
Aif^fl/y Kras^G12D小鼠在吸入Ad5-CMV-Cre后存活的时间明显长于对照组小鼠。在敲除AIF的小鼠中重新表达WT AIF后，存活率显著降低。而且线粒体锚定突变体AIF替代内源性AIF也恢复了Aif^fl/y Kras^G12D小鼠的癌症表型（图6c）。另外WT或突变AIF的重新表达导致肺肿瘤负荷增加（图6d，e）。接下来为了进一步研究AIF和OXPHOS在肿瘤细胞增殖和肿瘤干细胞样特性中的功能相关性，我们采用最近开发的3D肿瘤球体培养法，从Ad5-mSPC-Cre感染6周后的Aif^+/y Kras^G12D、Aif^fl/y Kras^G12D、Aif^fl/y WT ki Kras^G12D、Aif^fl/y MT ki Kras^G12D小鼠中分离纯化的原发肺细胞，进行细胞培养。在从每个基因型中植入相同数量的肿瘤细胞后，我们发现Aif^fl/y Kras^G12D小鼠与Aif^+/y Kras^G12D小鼠相比，来自Aif^fl/y Kras^G12D小鼠的肿瘤球体数量显著减少。WT和突变型AIF的重新表达几乎完全恢复了茎样性质，形成肿瘤球形，达到AIF ^+/y Kras^G12D对照水平（图6f，g）。接下来，我们通过BrdU标记来确定这些肿瘤球的增殖能力。再次，我们观察到Aif^fl/y Kras^G12D肿瘤球体中阳性细胞明显少于AIF WT、AIF WT敲入和AIF突变敲入肿瘤球体（图6h，i）。

6）WT或线粒体锚定AIF的修复可消除线粒体呼吸缺陷
将WT或线粒体锚定的AIF重新引入Aif^fl/y Kras^G12D肺细胞中，可将其呼吸能力提高到与AIF ^+/y Kras^G12D对照组相当的水平（图7a， b）。另外，与生物能量谱一致，AIF缺陷细胞所含PEP和NADH明显减少，但乳酸含量高得多（图7c），这表明AIF耗尽后OXPHOS确实受到抑制。另外，三羧酸循环的中间代谢物，包括柠檬酸、苹果酸和琥珀酸，在AIF缺乏的细胞中大量增加（图7c），这与KEGG富集分析一致（图7d）。

7）AIF在人类肺肿瘤中经常过度表达，高AIF表达与低生存率有关
最后，我们通过分析已发表的数据集，探讨AIF在人类肺癌中的临床意义。肺癌和不同肺癌亚型的转录组研究表明，与正常组织相比，肺癌组织中AIF mRNA水平显著上调（图8a）。为了在蛋白水平上验证这一发现，我们用免疫组织化学方法研究了AIF在人类肺癌样本中的表达。与之前的研究结果一致，我们观察到Kras突变和Kras WT肺癌患者的肿瘤组织中AIF表达均高于正常肺组织（图8b）。另外，我们发现，在三个不同的NSCLC群体中，不仅AIF，而且编码复合物I亚基或其组装因子的绝大多数基因在NSCLC组织中都比正常相邻肺组织明显过表达（图8c）。因此，当我们用Ad5-mSPC-Cre感染Aif^+/y和Aif^+/y Kras^G12D小鼠的肺细胞时，在激活Kras^G12D 8天后检测到AIF表达显著诱导；然而，在表达WT Kras的非转化性肺细胞中没有观察到这种效应（图8d）。此外，我们通过分析TCGA数据集中的RNAseq数据，评估了AIF表达与总生存率之间的相关性。发现无论KRAS突变情况如何，AIF高表达与预后不良呈负相关（图8e）。同样，免疫组化检测显示，NSCLCs表达低水平AIF蛋白的患者比AIF高肿瘤患者生存时间更长（图8f），这与AIF高表达与预后不良相关的结论一致。