新发现-双功能探针揭示铁死亡伴随•OH产生和细胞质粘滞度增加

   近日，Li H等人在J Am Chem Soc发表一篇 “Ferroptosis Accompanied by OH Generation and Cytoplasmic Viscosity Increase Revealed via Dual-Functional Fluorescence Probe.”的SCI文章。他们利用自己设计的双功能荧光探针(H-V)实现了铁死亡过程中羟基自由基（•OH）产生和细胞粘滞度改变的同时检测，揭示了铁死亡伴随着羟基自由基产生和细胞质粘滞度增加。这是首次报道单个探针就可以实现对铁死亡过程发生的多种变化进行追踪、检测。
   Stockrop等人在2012年新提出的Ferroptosis是一种调控细胞死亡的形式，不同于caspase依赖的细胞凋亡铁死亡的研究具有重要的生理和病理意义，因为它可能为疾病治疗和药物设计提供新的灵感虽然铁死亡的分子机制和代谢途径很复杂，但很明显，该过程是铁依赖性的，脂质过氧化物的形成与活性氧（ROS）有关；脂质过氧化物的积累是细胞死亡的主要原因。然而，尚不确定哪种ROS在铁死亡过程中的脂质过氧化中起关键作用。有证据表明，最具活性的ROS羟基（.OH）具有强大的氢吸收能力，能够引发脂质过氧化反应。此外，生物系统中。.OH的生成主要是通过Fenton反应（Fe2++H2O2）和Haber-Weiss反应（Fe3++O2.-），它们与铁死亡相似，都与铁的参与有关。因此，可以合理地假设.OH的过量产生可能是铁死亡中脂质过氧化的重要原因。然而，关于该主题的研究尚未见报道，尽管在ROS荧光下观察到总的细胞内ROS增加，但在铁死亡过程中.OH水平如何变化仍是未知的。例如2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFDA），等对.OH缺乏选择性的探针。 另一方面，细胞内黏度是一个基本因素，或者是一些细胞过程的基础，例如生物活性物质的扩散和信号的传递。某些疾病可能涉及细胞中粘度的正常变化。此外，由于细胞皱缩和细胞质凝缩，折皱中的细胞质粘度是细胞凋亡的重要形态学特征。由于ferroptosis在形态上与细胞凋亡不同，对于揭示铁死亡是否伴随细胞粘度改变具有重要意义。
   目前的荧光探针只能单独检测羟基自由基产生或细胞质粘滞度变化。这使得检测过程复杂，也无法准确揭示羟基自由基与细胞质粘滞度在铁死亡过程中的关系。因此，该课题开发了荧光探针(H-V)实现了对铁死亡过程中羟基自由基和细胞质粘滞度的同时成像。作者利用分子转子策略和芳环羟基化设计出探针H-V。分子转子有两个对称的小π-共轭。在分子转子中，吲哚部分是电子受体，anisole是电子供体，它们是通过可旋转的ethylene基键形成D-π-A结构连接起来的。随着微环境粘滞度的增加，分子内旋转受到限制，从而抑制了非辐射过程中分子内扭转电荷转移，导致探针荧光增强。另一方面，芳环的羟基化被用来提高检测•OH的选择性，而强供给电子基（甲氧基）的加入能够增强探针对•OH的捕获能力，提高检测灵敏度。此外，探针H-V中还引入了两个磺酸盐基团来中和正电荷。在H-V的donor-two-acceptors结构中，•OH造成的羟基化主要发生在甲氧基的间位上，形成Phenol intermediate，然后发生去质子化和电子重排,最终形成一个大π共轭系统(图1)。从探针H-V到product 1光谱发生很大的红移，并且有很鲜明的近红外荧光变化，从而实现用独立的通道检测•OH，避免了粘滞度检测通道的交叉信号。

                                          图1. H-V对粘滞度和羟基自由基响应的机理

   在探针被合成出来之后，首先研究了探针H-V对粘滞度的响应情况。探针H-V的紫外吸收在400 nm,而在520nm处有微弱的荧光发射。然后以甲醇甘油体系模拟粘滞度，研究发现随着粘滞度的增加，520 nm处的荧光显著增强。在纯甘油中的荧光比在纯甲醇中的荧光增加了50倍。这表明探针H-V对粘滞度非常敏感。随后，随后研究了探针H-V对•OH的响应情况。该报道运用Fenton反应提供•OH。随着Fenton试剂的增加，在652 nm处的荧光显著增强，最高增强了450倍。而在其他活性氧的反应中，并没有明显的荧光增强。这表明探针H-V对•OH有非常高的选择性。

                                        图2.探针对粘滞度和羟基自由基响应的荧光变化

                                         图3. HT-1080细胞中细胞质粘度变化的成像

H-V适用于细胞内•OH的独立成像

                                       图4. 探针对细胞质粘滞度和羟基自由基的独立成像

   基于图4结果基础上，此文献研究了在铁死亡过程中，探针H-V对细胞质粘滞度和•OH的成像。通过erastin诱导细胞铁死亡，收集两个独立通道的荧光信号，同时监测细胞内•OH的特异性变化和粘滞度变化。随着erastin孵育的时间增长，红色和绿色通道的荧光强度都增强，而使用铁死亡抑制剂（DFO，Fer-1，Lip-1）后，荧光强度受到显著抑制。上述结果表明，铁死亡伴随着胞浆粘滞度增加和•OH生成。

                                    图5.铁死亡中H-V对细胞质粘滞度和•OH的成像