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   NH3是一种已知的有害气体，会对我们的呼吸系统造成伤害。NH3存在于阴霾中，会形成二次有机气溶胶，进入呼吸道对健康产生不利影响。但是，尚未确定由NH3引起的气管的具体损害机制。ceRNA调控机制及其多种作用已在许多病理机制中提出。本文作者以肉鸡为材料，研究了NH3吸入后ceRNA在鸡气管中的功能作用。本文于2019年11月发表在Journal of Hazardous Materials（IF：7.65）上。
本文思路如下图所示：

本文研究结果如下：
1、气管细胞超微结构观察
   如图1，透射电镜下正常对照（C组）气管细胞形态正常，细胞膜边缘清晰完整，线粒体大小正常，无异常结构变化。 然而，NH3暴露组（H组）具有许多细胞坏死的典型特征，包括集中的纤毛细胞核，核仁缺乏，线粒体肿胀，空泡化，甚至细胞质破裂，伴随细胞膜破裂。以上证实，NH 3可以诱导气管细胞坏死。

                                              图1 用透射电镜(TEM)观察暴露于NH3的气管

2、lncRNAs和miRNAs的聚类分析
   RNA测序中鉴定出79个差异表达的lncRNA（DE-lncRNA）（图2A）和21个差异表达的miRNA（DE-miRNA）（图2C）。此外，作者发现lncRNA-107053293和miR-148a-3p（图2 B，红色方框所示）在调控NH3代谢过程中可能是重要的功能原件，因而以此为目标进行下一步分析。

                                              图2 lncRNAs和miRNAs的聚类分析

3、lncRNA-107053293和miR-148a-3p对NH3暴露后气管中FAF1表达的影响
   图3 A是作者筛选的5条显著差异表达的lncRNA进行qRT-PCR验证，其中lncRNA-107053293差异最显著。此外，qRT-PCR显示miR-148a-3p在H组中显著上调表达（图3B）。miR-148a-3p的靶基因FAF1（已知的抑制细胞凋亡）在H组中显著下调表达（图3C和D）。所以作者猜测气管在暴露于NH3引发的凋亡可能与lncRNA-107053293和miR-148a-3p有关。

                                        图3 lncRNA-107053293、miR-148a-3p、FAF1在气管中的表达水平

4、NH3暴露后气管内坏死相关基因的表达
   基于FAF1的表征，作者检测了RIPK1，RIPK3，MLKL，FADD和caspase 8的表达，这些蛋白均与细胞坏死有关。正如预期，暴露于NH3后，气管中RIPK1，RIPK3，MLKL和FADD表达都升高了。并且在mRNA水平上，FADD，RIPK1和RIPK3表达升高超过2倍，而MLKL增加1.5倍，caspase 8减少约60％（图4A）。类似的，上述蛋白的蛋白水平表达趋势得出一致的结论（图4B）。结合前人的研究，caspase 8下调细胞坏死会增加，因此，作者得出结论，NH3暴露后可能通过激活caspase 8引发气管坏死。

                                               图4 检测导致气管组织坏死的基因

5、lncRNA-107053293/miR-148a-3p/FAF1相互作用网络
   亚细胞定位显示lncRNA-107053293主要在细胞质中表达（图5A），之后构建了lncRNA-107053293/miR-148a-3p/FAF1组件，如图5B，双荧光素酶实验显示三者之间确实存在结合位点可相互作用（图5C和D）。
   此外，过表达lncRNA-107053293，miR-148a-3p的表达显著下调，但FAF1表达水平显著升高（图5E和F）。相反，miR-148a-3p过表达lncRNA-107053293和FAF1的丰度都下降了，而FAF1蛋白水平下降的更为明显（图5G）。以上表明， lncRNA-107053293可通过螯合miR-148a-3p来调节FAF1的表达。

                                     图5 lncRNA-107053293/miR-148a-3p/FAF1相互作用网络

6、氯化铵致LMH（鸡肝细胞癌细胞系）坏死
   作者摸索了不同浓度氯化铵用于NH3暴露的最佳浓度，如图6A， 50 mM氯化铵杀死了一半的细胞，所以作者最终选择5 mM浓度的氯化铵，此时细胞存活率大于95％。此外，流式结果显示对照组中只有0.559％的细胞坏死，而当暴露于氯化铵时，有25.3％的细胞坏死（图6B）。

                                                 图6 CCK-8和流式检测的结果
   为了验证上述结果，作者检测了气管细胞中坏死相关基因的mRNA和蛋白质表达，如图7A和B所示，氯化铵模拟的NH3暴露后，组织中FADD和MLKL表达增幅最大，其次是RIPK1和RIPK3。以上结果表明氯化铵可导致细胞坏死。

                                                   图7坏死相关基因的表达
   总之，本文进一步阐明了氨致鸡气管损伤的生物学机制，为氨毒理学研究奠定了更深层次的理论基础。此外，本文的实验手段并不复杂，但发了7分的杂志，值得借鉴。
参考文献：
   Wang Wei., Shi Qunxiang., Wang Shengchen., Zhang Hongfu., Xu Shiwen., (2019). Ammonia regulates chicken tracheal cell necroptosis via the LncRNA-107053293/MiR-148a-3p/FAF1 axis., J. Hazard. Mater., undefined, 121626.