自噬相关蛋白PIK3C3/VPS34控制T细胞代谢和功能

    Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶（PtdIns3K）复合物的PIK3C3/VPS34亚基是大自噬/自噬的早期关键因子。在这项研究中，我们评估了PIK3C3对T细胞代谢和功能的贡献。这篇文章发表于“Autophagy”，题目为“Autophagy-related protein PIK3C3/VPS34 controls T cell metabolism and function”。

    在这篇研究中，我们发现Pik3c3-31缺陷型T细胞表现出细胞代谢受损，Pik3c3缺陷型CD4+T 细胞未能分化为T辅助细胞。这些改变与T细胞活化时活性线粒体减少水平有关。此外，有条件的Pik3c3缺陷动物未能产生自身反应性T细胞反应，对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）有抵抗力。有趣的是，Pik3c3的缺失对动物清除肿瘤转移的能力几乎没有影响。
结 果：
1.Pik3c3基因在T细胞中的缺失重组基因表达
    为了更好地了解Pik3c3缺失对T细胞功能的潜在影响，我们产生了Pik3c3f/f，Cd4-Cre小鼠，其在T细胞中表现出选择性的Pik3c3消融。我们研究了来自Pik3c3f/f 和pik3c3f/f，Cd4-Cre小鼠的富含FACS的CD4+和CD8A+T细胞的转录组。RNA测序分析显示，转录水平在全基因组范围内发生了显著变化。CD4+T细胞中Pik3c3缺乏显著诱导或降低基因表达，包括Pik3c3（图1A）。随后的途径富集分析确定了Pik3c3缺陷CD4+T细胞中受影响有糖酵解/糖异生、氨基酸生物合成、N-聚糖生物合成和cAMP信号途径（图1B）。CD8A+T细胞中Pik3c3缺陷也诱导或减少基因表达，包括Pik3c3（图1C）。然而，富集分析没有显示任何细胞代谢改变的证据（图1D）。相反，受影响最显著的途径与唾液分泌、MAPK 信号途径和麻疹相关（图1D）。许多细胞代谢相关基因在CD4+T中被调控超过10倍（图1E）。我们还观察到Pik3c3缺陷性CD4+T细胞中Th1细胞特异性转录因子Tbx21的表达降低（图1E）。相比之下，其他Th细胞转录因子如Gata3、Rorc和Foxp3的表达没有显著差异（图1E）。

2.Pik3c3缺失引起活化T细胞线粒体功能和代谢的改变
    我们之前已经证明pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠的外周T细胞丢失是由于细胞器的积累和稳态时细胞凋亡的增加。因此，我们进一步研究了PIK3C3在T细胞克隆扩增过程中对T细胞存活的作用。我们用抗CD3E和抗CD28抗体对Pik3c3f/f和pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠的脾细胞进行了刺激，并用流式细胞仪测定了刺激后活细胞的百分比。Pik3c3缺失T细胞的百分比明显低于富含Pik3c3 的T细胞，后者增殖缓慢（图2A和2B）。由于自噬是维持激活后ATP产生的必要条件，我们接下来评估了自噬失败对T细胞代谢的影响。我们用细胞外流量分析仪测量了活化T细胞的耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）的变化，分析了活化T细胞的线粒体呼吸和有氧糖酵解。Pik3c3缺乏显著降低活化的CD4+和CD8A+T 细胞的OCR和ECAR（图2C、2D）。这一结果证实了RNA序列数据，即与糖酵解和氧化磷酸化相关的基因被下调（图1E）。有趣的是，与CD8A+T细胞相比，CD4+T细胞OCR和ECAR的降低更为显著。
    为探讨Pik3c3f/f和 pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠T细胞代谢的不同机制，我们评估了T细胞系的线粒体质量和功能。与对照T细胞相比，缺乏Pik3c3的CD4+和CD8A+T细胞的基础Mitoview（线粒体膜染色）染色增强，表明缺乏Pik3c3时线粒体有积累（图2E和2F）。在Pik3c3f/f和pik3c3f/f；CD4-Cre小鼠中，CD4+或CD8A+T细胞的激活导致了有丝分裂染色的显著增加（图2E和2F）。然而，与Pik3c3缺陷的CD4+T细胞相比，Mitoview染色在Pik3c3足够的CD4+T细胞中的增加更为显著。我们假设，Pik3c3缺陷T细胞代谢减少可能是由于线粒体状态的改变和线粒体负荷。为了测试这一点，我们用四甲基罗丹明乙酯高氯酸盐（TMRE）对细胞进行染色，发现与Pik3c3f/f；Cd4 Cre小鼠相比，刺激导致Pik3c3f/f小鼠的CD4+和CD8A+T细胞线粒体膜电位升高（图2E和2F）。CD4+T细胞活化诱导TMRE的增加比CD8A+T细胞的高。总的来说，这些结果表明PIK3C3在T细胞活化过程中维持健康的线粒体负荷增加需要，特别是在CD4+T细胞中。

3.T细胞Pik3c3缺失抑制Th1细胞分化
    先前的研究表明，自噬在不同的T辅助亚群中受到不同的调节。因此，我们接下来评估Pik3c3缺乏是否调节T辅助细胞分化。我们在Th1、Th2、Th17和Treg偏斜条件下培养MACS分选的Pik3c3足够和缺失的CD4+SELL/CD62L+T细胞，然后用抗CD3E抗体重新激活细胞，以评估每个亚群的标志性细胞因子或转录因子的表达。我们发现在这些不同极化条件下培养的原始CD4+T细胞在Pik3c3缺失时对细胞死亡有不同的敏感性。Pik3c3缺乏的T细胞在Th1下，Th2和Treg条件下培养更加敏感，而在Th17细胞培养条件下对细胞死亡敏感性相对较低（图3 A和B）。在Th1细胞条件下，在缺乏Pik3c3的情况下，产生IFNG细胞的比例显著降低（图3C和3D）。然而，在Th2条件下培养的细胞中， IL4的表达没有差异，IL17A在Th17条件下培养的细胞中表达没有差异，FOXP3在Treg条件下培养的细胞中表达没有差异，（图3C和3D）。这些数据证实了我们的RNA序列研究中转录变化的无偏测量，表明减少了Tbx21的表达，但在缺乏CD4+T细胞中Gata3、Rorc和Foxp3的表达没有差异（图1E）。

4.T细胞Pik3c3缺乏导致对EAE诱导的抵抗
    我们推测Pik3c3缺失抑制自身免疫反应的发展。我们使用多发性硬化的EAE模型来测试T细胞中Pik3c3缺失是否导致EAE诱导的抵抗。结果表明，pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠对EAE完全耐药，而在同一实验中，所有pik3c3f/f小鼠均出现EAE征象（图4A）。我们认为pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠对EAE诱导的抗性增加可能与T细胞启动减少有关。因此，我们评估了抗原特异性T细胞反应，发现在pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠中，MOG 211（髓鞘少突胶质细胞糖蛋白）特异性IFNG+CD4+T细胞显著减少（图4B）。IL17+CD4+T细胞也适度减少，尽管没有统计学差异（图4B）。另外，我们发现所有的rubcn-/-小鼠都出现了EAE症状，与WT对照小鼠相似（图4C）。这些结果表明pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠对EAE诱导的保护作用最有可能不是由有缺陷的非规范自噬引起的。
    为了更好地确定EAE对T细胞Pik3c3缺乏的抗性，我们用Rosa26-CreERT2小鼠培育Pik3c3f/f小鼠，产生Pik3c3f/f；Rosa26-CreERT2小鼠。从MOG35-55免疫动物获得的4-OH三苯氧胺处理的ER-Cre+细胞过继转移到同源WT（PTPRCa/CD45.1）动物，导致对EAE发育的保护，而在同一个实验中，接受载体处理的ER-Cre+细胞的动物出现EAE迹象（图4D）。我们随后测定了小鼠中枢神经系统浸润白细胞的频率。接受4-OH三苯氧胺处理的ER-Cre+细胞的小鼠的中枢神经系统浸润PTPRCb/CD45.2+细胞和CD4+T细胞的比例明显低于接受载体处理的ER-Cre+细胞的小鼠（图4E和4F）。总之，这些数据表明，PIK3C3在自身免疫反应的诱导和效应阶段都具有关键作用。

5.未改变的肿瘤转移易感性
    为了确定Pik3c3在肿瘤转移中的重要性，我们用静脉注射Lewis肺癌（LLC）细胞或B16黑色素瘤细胞对Pik3c3f/f和pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠进行了检测，并监测了肺肿瘤的定植情况。有趣的是，与Pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠相比，Pik3c3f/f小鼠具有相似的LLC和B16黑色素瘤肿瘤负荷（图5A-C）。为了更好地理解潜在的机制，我们分析了肿瘤定植肺中的免疫细胞群。我们在Pik3c3f/f和Pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠的肺中发现了相似的细胞总数。肿瘤的免疫组织学分析证实pik3c3f/f；CD4-Cre小鼠CD4+T细胞和CD8A+T细胞的频率降低（图5D）。流式细胞术分析显示， pik3c3f/f；CD4-Cre小鼠CD4+T细胞、CD8A+T细胞和Tregs、未改变的B细胞和MDSCs的频率显著降低，而KLRB1C/NK1.1+细胞增加（图5E和5F）。CD8A+T细胞表型分析显示pik3c3f/f；Cd4-Cre 255小鼠的效应细胞CD44+SELL-T细胞频率增加（图5G）。然而，Pik3c3缺乏并没有改变PTPRC/CD45+257细胞对LLC肿瘤细胞的抗肿瘤细胞溶解功能（图5H和5I）。总的来说，结果表明，T细胞中Pik3c3的缺失对效应细胞清除肿瘤转移的功能影响有限。

结 论：
    总之，我们的数据揭示了PIK3C3在T细胞代谢和功能中的关键作用。T细胞中的PIK3C3在EAE过程中也可能通过典型的自噬依赖途径参与这些细胞的致病性。因此，我们的研究对通过靶向PIK3C3治疗多发性硬化和其他自身免疫性疾病的有效免疫疗法的发展具有意义。