外泌体circRNA参与肿瘤免疫治疗

    外泌体，circRNA，肿瘤免疫微环境和肿瘤免疫治疗的都是近年来生命科学研究热点，也是国自然基金申请重点领域。今天我们讲一篇2020年6月27日发表在Molecular Cancer的文章，题名：Cancer Cell-Derived Exosomal circUHRF1 Induces Natural Killer Cell Exhaustion and May Cause Resistance to anti-PD1 Therapy in Hepatocellular Carcinoma。这篇文章来自复旦大学附属中山医院研究团队，文章主要讲述了外泌体circUHRF1主要由HCC细胞分泌，通过诱导HCC中的NK细胞功能障碍参与免疫抑制，CircUHRF1可能驱动抗PD1免疫疗法的耐药性。

技术路线:

结 果：
一、肝癌组织中与UHRF1相关的circRNA的分析

    具有PHD和RING指域1（UHRF1）的泛素样蛋白是参与调节DNA甲基化的关键分子，通常在包括HCC在内的许多癌症中过表达。UHRF1过表达可促进肝癌的发生和发展。因此，作者推测UHRF1衍生的circRNA表达可能被上调并可能促进HCC的进展。
    qRT-PCR检测从UHRF1衍生的14个circRNA的表达水平，qRT-PCR又检测circUHRF1在240例HCC组织和癌旁的表达，肝癌组织高表达。circUHRF1 高表达的HCC患者肿瘤较大并血液中的NK细胞比例降低，微血管转移增多。KM生存分析表明circUHRF1 高表达患者的临床预后较差。数据表明，HCC细胞中circUHRF1表达上调与患者不良预后相关，并表明circUHRF1表达增加可能与HCC的进展有关。

二、HCC细胞以外泌体方式分泌circUHRF1
    从HCC细胞系上清液中分离了外泌体，并通过TEM和Western blot对其进行了评估。在6个HCC细胞系及对应的外泌体中进行qRT-PCR检测， HCCLM3和SMMC-7721细胞系中circUHRF1显著上调，且外泌体中circUHRF1的表达趋势与亲代细胞的一致。与健康供体相比，HCC患者的血浆外泌体circUHRF1水平升高。肿瘤切除后血浆外泌体circUHRF1水平降低，而在肿瘤复发患者中升高，这表明血浆外泌体circUHRF1主要由HCC细胞产生。有免疫逃逸的患者血浆中外泌体circUHRF1水平显著升高，外周血中NK细胞比例降低。这些数据表明血浆外泌体circUHRF1可以作为NK细胞相关的免疫逃逸的关键分子。

三、HCC细胞通过外泌体circUHRF1抑制NK细胞功能
    将来自健康供体的NK细胞与HCCLM3和SMMC-7721细胞以1：1的比例共培养24h。与NK细胞相比， SMMC-7721和HCCLM3细胞共培养的NK细胞在随后与K562细胞共培养时表现出IFN-γ和TNF-α分泌的显著降低。SMMC-7721和HCCLM3细胞共培养的NK细胞中circUHRF1表达显着增加，并受到外泌体抑制剂GW4869的抑制，抑制剂GW4869处理后IFN-γ和TNF-α表达恢复正常水平。使用shRNA慢病毒载体构建HCCLM3和SMMC-7721 circUHRF1敲低细胞。在circUHRF1敲低细胞中外泌体circUHRF1的表达显着降低，外泌体circUHRF1水平的降低有效减弱了HCC衍生的外泌体诱导的NK细胞中IFN-γ和TNF-α分泌的损伤。结果表明，源自HCC的外泌体circUHRF1损害NK细胞的功能。

四、CircUHRF1和miR-449c-5p在NK细胞中相互作用
    通过StarBase v3.0分析，预测有14个miRNAs可能是circUHRF1的靶标。使用circUHRF1特异性探针进行circRNA免疫沉淀（circRIP），并使用qRT-PCR检测到了与circUHRF1形成复合体的14种预测miRNA。与对照相比，circUHRF1和miR-449c-5p显着富集，而其他miRNA没有富集或仅有少量富集。在NK-92细胞中进行了AGO2-RIP实验，抗AGO2抗体显着富集了circUHRF1和miR-449c-5p，pulldown和荧光素酶基因报告实验也验证这一结果。在NK-92细胞中过表达miR-449c-5p后，circUHRF1的水平显着降低，而在circUHRF1过表达后，miR-449c-5p的水平显着降低。结果证实，circUHRF1是miR-449c-5p分子海绵，且在在NK细胞中相互影响。miR-449c-5p的过表达表达显着抑制肿瘤活性（促进IFN-γ和TNF-α分泌），增加circUHRF1表达可显着抑制miR-449c-5p的肿瘤抑制功能，证明了了HCC衍生的外泌体circUHRF1可能通过miR-449c-5p相关途径抑制NK细胞功能的关键能力。

五、CircUHRF1通过抑制miR-449c-5p活性上调TIM-3表达
    StarBase v3.0预测了miR-449c-5p在TIM-3上的结合位点，荧光素酶基因报告实验验证预测结果。miR-449c-5p的过表达后TIM-3表达显着降低。回复实验表明miR-449c-5p过表达导致TIM-3的mRNA和蛋白表达降低，而circUHRF1逆转了miR-449c-5p对TIM-3表达的抑制作用。接下来调查了40例HCC患者外周血NK细胞中circUHRF1和miR-449c-5p / TIM-3表达之间的相关性。外周血NK细胞中circUHRF1表达与miR-449c-5p表达负相关，且与TIM-3 mRNA表达呈正相关，miR-449c-5p表达与外周NK细胞中TIM-3 mRNA的表达呈负相关。表明外泌体circUHRF1的上调消除了miR-449c-5p对NK细胞中TIM-3的肿瘤抑制作用。

六、CircUHRF1以NK细胞依赖性方式诱导HCC进展
    使用慢病毒载体在PLC / PRF / 5细胞中构建circUHRF1过表达细胞系。结果显示过表达成功，且外泌体中circUHRF1表达升高。使用上述细胞进行裸鼠肺转移模型构建（注射健康供体的NK细胞），过表达circUHRF1的PLC / PRF / 5细胞转移性肿瘤结节数显着增加，转移小鼠的血清外泌体circUHRF1水平升高，转移性肿瘤结节中NKG2D阳性细胞的数量明显减少。这些结果表明circUHRF1以外泌体和NK细胞依赖性方式促进HCC进展。

七、CircUHRF1增强HCC对抗PD1治疗的抵抗力
    作者分析了30例接受抗PD1免疫治疗的复发性远处转移（包括肺转移）的HCC患者的回顾性数据，这些患者在免疫治疗前2-36个月接受了肝切除术。六个治疗周期后，使用CT评估疗效。结果显示，部分缓解（PR）3例，疾病稳定（SD）7例，进行性疾病（PD）20例。测量circUHRF1的表达显示，PD组的circUHRF1的表达水平远高于SD和PR组。为了进一步探讨circUHRF1与免疫逃避之间的关系，检查了30例HCC患者组织中NKG2D的表达。与易受PD1治疗的HCC患者相比，抗PD1治疗的HCC患者的NKG2D阳性细胞数量明显减少，HCC组织中circUHRF1表达与NKG2D阳性细胞数呈负相关。为了进一步评估circUHRF1对抗PD1治疗的抗性，通过皮下植入circUHRF1基因敲除的HCCLM3细胞建立了异种移植模型。circUHRF1敲低细胞可提高对抗PD1治疗的敏感性并提高总生存率。综上所述，这些发现表明过表达circUHRF1可能会阻碍HCC对抗PD1治疗的反应，而靶向circUHRF1可能是恢复HCC对抗PD1治疗敏感性的有前途和有效的方法。

结 论：
    HCC衍生的外泌体通过诱导NK细胞上TIM-3表达来抑制IFN-γ和TNF-α的产生。肿瘤外泌体通过circUHRF1抑制NK细胞功能，为HCC细胞与NK细胞之间的串扰提供了新证据。