Mydgf促进心肌细胞增殖和新生心脏再生

    骨髓源性生长因子（Mydgf）是一种由骨髓源性单核细胞和巨噬细胞分泌的旁分泌蛋白，在成年小鼠心肌梗死（MI）后具有抗心肌损伤的作用。因此小编为大家介绍发表于“Theranostics”杂志的文章“Mydgf promotes Cardiomyocyte proliferation and Neonatal Heart regeneration”，给大家介绍Mydgf与心脏再生。

    在本研究中，我们发现心肌损伤后，Mydgf在新生小鼠心脏中被显著诱导。Mydgf缺乏阻碍心肌细胞（CM）增殖和心脏再生。Mydgf重组蛋白对CM的体内外增殖均有促进作用。RNA测序鉴定c-Myc/FoxM1通路介导Mydgf的促增殖作用。Mydgf治疗可促进心肌梗死后成年小鼠CM增殖和心脏再生，提示Mydgf可能是心肌损伤恢复的有效再生因子。
结 果：
1.Mydgf是在新生心脏再生过程中被诱导的
    我们采用qRT-PCR和western-blot检测野生型小鼠出生后心脏发育过程中Mydgf的表达。我们发现Mydgf在出生后第4天（P4）略有增加，然后随着年龄的增长逐渐降低（图1A-D）。为了研究Mydgf是否参与了新生心脏再生，我们对P1心脏进行了根尖切除术（AR），并测量了Mydgf在切除后不同时间点的表达（图1E）。Western blot和qRT-PCR显示，Mydgf表达在切除后1、4、7、14和21天显著增加（图1F-H）。接着，为了确定心脏再生过程中产生Mydgf的细胞类型，我们在AR后使用流式细胞术对巨噬细胞（MΦs）、CMs和内皮细胞（ECs）进行分类，并通过qRT-PCR验证三个细胞群的纯度。我们发现，在1dpr时，Mydgf主要由ECs而不是MΦs表达（图1I）。此外，我们还构建了Mydgf-EGFP小鼠，包括连接体EGFP和左（1302bp）和右（1765bp）2条同源臂，以研究Mydgf的合成。免疫组化显示EGFP与CDH5+细胞共定位，CDH5+细胞是ECs在7dpr时的标记，提示ECs是新生儿心脏损伤后的主要细胞类型（图1J）。

2.Mydgf是心脏再生和CM增殖所必需的
    我们对P1-Mydgf-KO小鼠进行了AR，并评估了心脏再生。Masson染色分析显示，与WT小鼠相比，Mydgf KO小鼠在21 dpr时的纤维化显著增大，再生能力显著降低（图2A-B）。超声心动图显示，与WT小鼠相比，Mydgf KO小鼠在21 dpr时心脏功能更差（图2C-D），表明Mydgf是心脏再生所必需的。心脏再生反应的中心特征是损伤后CM增殖的激活。我们在P1 Mydgf-KO小鼠上进行AR手术，并在7 dpr时，通过免疫荧光检测有丝分裂标记物磷酸化组蛋白3（pH3）、Ki67和Aurora B（Aurkb）（图2E）。我们发现Mydgf缺乏对AR损伤后CM的增殖是有害的（图2F-K）。最后，我们用共焦显微镜测定了CM倍体，这使得单个CM细胞核中DNA含量的定量成为可能（图2L）。以非CMs作为二倍体（2N）细胞核的参照物，Mydgf-KO-CM细胞核在14 dpr的双核CMs中2N核减少了40%，多倍体（4N和>4N）增加了30%（图2M），表明Mydgf缺乏减少了核分裂，从而增加了倍性。

3.Mydgf足以促进CM增殖和心脏再生
    为了研究Mydgf是否能刺激CM增殖，我们从WT小鼠中分离出新生的原发性CMs，并用Mydgf重组蛋白处理（图3A）。免疫荧光染色显示，与PBS组相比，Mydgf处理的CMs在16小时后pH3+、Ki67+和Aurkb+CMs显著增加（图3B-G），表明Mydgf促进CM体外增殖。
    我们将Mydgf重组蛋白微注射到Mydgf- KO P1小鼠AR损伤后的心肌中（图3H）。Masson染色和超声心动图分析表明，用Mydgf处理的Mydgf- KO小鼠表现出完全的心脏再生（图3I-J）和收缩功能障碍的增强（图3K-L）。我们还通过免疫荧光染色检测7dpr处CM增殖，发现在7dpr时CM增殖显著增强（图3M-R）。这些结果表明，Mydgf能促进CM的体内增殖，促进心脏损伤后新生心脏的再生。

4.Mydgf通过c-Myc/FoxM1途径控制CM增殖
    我们利用RNA测序研究了Mydgf处理的新生小鼠的基因表达谱（图4A），发现在Mydgf治疗16小时后，共有1005个基因差异表达，包括298个下调基因和707个上调基因。通过KEGG对上调基因的分析显示细胞周期和PI3K-Akt信号通路的显著富集。Western blot显示Mydgf处理的CMs中细胞周期相关蛋白Cyclin B1、Cyclin D1、CDK1和CDK6以及Akt（Ser473）的磷酸化（p）明显增加（图4B）。Mydgf-和PBS处理的CMs之间的细胞周期基因热图如图4C所示。我们发现Mydgf处理的CMs中FoxM1和Myc显著增加（图4D）。此外，我们还发现，与假手术对照组相比，在4和7dpr时，野生型小鼠心肌中的c-Myc和FoxM1均增加（图4E）。最后，我们还对新生的Mydgf-KO和WT小鼠进行了AR手术。Western blot显示，Mydgf缺乏可降低4 dpr和7 dpr的p-Akt、c-Myc和FoxM1的表达（图4F），表明c-Myc和FoxM1在心脏再生中不可或缺。
    FoxM1和c-Myc都被确定为促增殖因子。我们发现，Mydgf诱导的CM增殖分别通过敲除Akt、c-Myc或FoxM1（图4G-L）而显著抑制。Western blot显示Akt抑制剂LY294002、siRNA-c-Myc和siRNA-FoxM1可以抑制Mydgf诱导的p-Akt、Cyclin B1、Cyclin D1和CDK1的激活（图4M）。我们还发现，Akt敲除抑制了c-Myc和FoxM1的表达，而c-Myc的敲除阻断了FoxM1的表达，而FoxM1的敲除对Akt和c-Myc没有影响（图4M），表明Akt介导的Mydgf通过c-Myc/FoxM1途径诱导CM增殖。

5.Mydgf促进成年小鼠心脏再生
    为了验证Mydgf在成年小鼠中的功能，我们建立了心肌梗死（MI）小鼠模型。我们将Mydgf重组蛋白微量注射到心肌梗死后的WT成年小鼠心脏中，然后连续尾静脉注射7天（图5A）。Masson染色和超声心动图分析显示，在21 dpi时，Mydgf处理的心脏显示梗死面积减小（图5B-C），并且出现不太明显的收缩功能障碍（图5D-E）。Mydgf处理的小鼠与显著的生存效益相关（图5F）。免疫荧光染色显示Mydgf处理的小鼠在7dpi时CM增殖增加（图5G-L）。这些结果表明，Mydgf可促进成年小鼠心肌梗死后心脏再生和CM增殖，提示Mydgf可能是逆转心肌重构和预防心力衰竭的有效靶点。

结 论：
    Mydgf通过激活c-Myc/FoxM1通路促进心肌细胞增殖，促进新生和成年小鼠心脏损伤后的心脏再生，为逆转心脏重构和心力衰竭提供了一个潜在的靶点。