外泌体circSHKBP1与胃癌进展间关系大揭秘

        circRNAs（circRNAs）在多种癌症的发生发展中起着重要的调控作用。然而，circRNAs在胃癌（GC）中的生物学功能及其分子机制尚不清楚。今天小编为大家带来发表于“molecular cancer”上的文章“Exosomal circSHKBP1 promotes gastric cancer progression via regulating the miR-582-3p/HUR/VEGF axis and suppressing HSP90 degradation”，为大家详细介绍circSHKBP1在胃癌发展中的机制。

        在本研究中，通过RNA测序鉴定差异表达的环状RNA。通过一系列体外和体内实验研究了circSHKBP1在GC中的生物学功能。通过实时定量PCR和RNA原位杂交检测circSHKBP1的表达，通过western blot、pull down、RNA免疫沉淀、荧光素酶检测和挽救实验证实了circSHKBP1的分子机制。最后，使用小鼠异种移植和生物发光成像检查体内circSHKBP1的临床相关性。我们的研究结果表明，外泌体circSHKBP1调控miR-582-3p/HUR/VEGF通路，抑制HSP90降解，并促进GC进展。
结 果：
1.circSHKBP1作为GC生物标志物的鉴定
        通过对GC组织和匹配的相邻正常组织的RNA测序分析，我们共鉴定出1445个不同的circRNA。共有119个circRNAs在癌组织和正常组织中有差异表达，其中5个circRNAs上调，114个circRNAs下调（图1a和b）。然后，我们进一步通过qRT-PCR分析，发现circSHKBP1是GC中表达差异最大的circRNA（图1c）。
        CircSHKBP1来源于蛋白编码位点SHKBP1，在人类组织中广泛表达。CircSHKBP1是由SHKBP1基因的第11和第12外显子与两侧内含子中的几个Alu元件反向剪接而产生的（图1d）。我们设计了跨越连接位点的聚合引物，通过Sanger测序证实了逆转录产物（图1e）。然后，我们分析了circSHKBP1在配对GC组织和正常组织中的表达情况。qRT-PCR分析显示，与正常组织相比，在GC组织中circSHKBP1表达上调（图1h，i）。此外，ISH检测显示，circSHKBP1在GC组织中的丰度远高于匹配的正常组织（图1f），并且circSHKBP1的表达与TNM晚期、血管侵犯和不良预后相关（图1g）。接着，鉴定了来自血清的外泌体中的circSHKBP1。与预期的一样，来自血清外泌体的circSHKBP1在GC患者中比健康对照组更丰富（图1j）。此外，血清外泌体中的circSHKBP1水平与胃癌患者肿瘤中的水平一致，约为肿瘤中的水平的6倍（图1k）。我们还研究了胃癌切除术前后血清中circSHKBP1的表达，发现肿瘤切除后circSHKBP1的表达急剧下降，表明胃癌组织是外泌体circSHKBP1的来源（图1l）。这些结果表明circSHKBP1是一种来自GC组织的上调的circRNA，circSHKBP1的高表达与TNM晚期及胃癌不良预后相关。

2.CircSHKBP1在体外促进GC细胞的增殖、迁移和侵袭
        为了研究circSHKBP1是否影响胃癌细胞的生物学过程，我们首先分析了circSHKBP1在人胃癌细胞系和胃正常上皮细胞系GES1中的表达情况。与GES1细胞相比，circSHKBP1在4种GC细胞系中均过表达，在BGC823和HGC27的表达尤为明显（图2a）。与GES1细胞相比，外泌体circSHKBP1在GC细胞系中也过表达（图2b-d）。因此，我们在接下来的分析中使用了BGC823和HGC27细胞。
        接着，我们对circSHKBP1进行了干扰。 CCK8和EdU检测显示，沉默circSHKBP1显著抑制了GC细胞的增殖（图2e，f，i）。Transwell检测显示，沉默circSHKBP1抑制了GC细胞的迁移和侵袭能力（图2j，k）。然而，过表达circSHKBP1增加了GC细胞的增殖、迁移和侵袭（图2g，h，l-n）。
        最后，我们从转染circSHKBP1质粒的BGC823和HGC27细胞的培养液中提取外泌体，并与不同浓度未处理的GC细胞共培养。正如预期的那样，外泌体circSHKBP1的过表达也影响了GC细胞的增殖、迁移和侵袭，促进了恶性细胞表型（图2o-q）。这些结果表明circSHKBP1促进了GC细胞的生长和转移。

3.CircSHKBP1作为miR-582-3p的海绵
        为了研究circSHKBP1在GC细胞中的作用机制，我们首先确认了它在GC细胞中的定位。FISH分析和qRT-PCR分析表明，circSHKBP1优先定位于GC细胞的细胞质内（图3a和b）。鉴于circRNAs作为miRNA海绵已被广泛研究，我们接下来研究了circSHKBP1的miRNA结合能力。我们进行RIP检测，观察到在BGC823细胞中内源性circSHKBP1下拉，被特异性地富集（图3c），这表明circSHKBP1起着miRNA海绵的作用。四个可能的miRNAs（miR-582-3p，miR-665，miR-1207和miR-4458）被预测。我们检测到这些miRNAs在circSHKBP1过表达的GC细胞中的表达，发现miR-582-3p和miR-665下调（图3d）。为了验证miR-582-3p/miR-665和circSHKBP1之间的直接相互作用，我们进行了双荧光素酶报告基因检测（图3e）。结果表明，与miR NC模拟物相比，miR-582-3p模拟物使circSHKBP1-miR-582-3p组的相对荧光素酶活性降低，而circSHKBP1-miR-582-3p突变体组的荧光素酶活性没有变化（图3f）。我们还进行了生物素标记的RNA下拉试验，证实了circSHKBP1和miR-582-3p的吸收（图3g）。此外，FISH实验证实了circSHKBP1和miR-582-3p在细胞质中共定位（图3h）。qRT-PCR显示，GC肿瘤中miR-582-3p水平低于配对正常组织，miR-582-3p与circSHKBP1的表达呈负相关（图3i和j）。
        最后我们证实miR-582-3p的生物学功能。CCK8和Transwell分析表明miR-582-3p模拟物抑制了GC细胞的增殖、迁移和侵袭，而circSHKBP1的过表达消除了这种对GC细胞发育的抑制作用（图3k-m）。

4.CircSHKBP1通过上调HUR促进VEGF的翻译
        通过生物信息学分析网站，我们发现了54个miR-582-3p候选靶蛋白（图4a），其中HUR和EIF2S1被报告为VEGF信号通路的一部分。血管内皮生长因子（VEGF）是促进内皮细胞增殖的重要因素之一，因此我们对VEGF途径进行了深入研究。WB分析显示，过表达circSHKBP1增加了HUR和VEGF的水平（图4b）。此外，miR582-3p模拟物降低了HUR和VEGF蛋白水平（图4b）。同样，沉默circSHKBP1降低了HUR和VEGF的水平，miR-582-3p抑制剂恢复了这些水平（图4c）。与对照组相比，HUR的RIP显示VEGF mRNA和miR-582-3p显著富集（图4d和e），进一步证实HUR是miR-582-3p的靶点，HUR直接与VEGF mRNA结合。我们还检测了GC组织中HUR mRNA的水平，发现HUR的表达与miR-582-3p呈负相关，而与CircSHKBP1呈正相关（图4f和g）。我们用不同浓度的贝伐单抗处理CircSHKBP1过表达的GC细胞，以确定CircSHKBP1是否通过VEGF加速肿瘤进展。WB分析显示，VEGF水平随着贝伐单抗浓度的增加而降低（图4h）。贝伐单抗以浓度依赖的方式降低GC细胞增殖和迁移能力（图4i-k），并且CircSHKBP1过表达细胞的抑制率远高于对照组（图4l）。试管形成试验进一步证实，CircSHKBP1促进VEGF分泌并诱导血管生成，贝伐单抗可抑制这一点（图4m和n）。

5.CircSHKBP1直接与HSP90相互作用并抑制其降解
        我们设计了一种特异性生物素标记的CircSHKBP1探针，用于HGC27细胞的RNA下拉分析。银染结果显示，与对照组相比，CircSHKBP1过表达的GC细胞中多个蛋白条带的富集（图5a）。蛋白质质谱分析用于鉴定差异表达的蛋白质。HSP90β 和HSP90α排名前两位，都是HSP90的亚型。RIP分析显示，与IgG相比，抗HSP90抗体拉下了丰富的CircSHKBP1（图5c），证实了CirchHKBP1和HSP90之间的直接相互作用。通过TCGA分析，HSP90在GC中上调（图5d）。采用qRT-PCR方法检测组织中HSP90 mRNA水平，ELISA法检测组织中HSP90蛋白水平。结果表明，与正常组织相比，GC肿瘤中HSP90 mRNA和蛋白均上调（图5e，f）。考虑到circRNA和蛋白质之间的相互作用，我们分析了HSP90蛋白的表达与CircSHKBP1之间的关系，发现它们是正相关的（图5g）。WB显示CircSHKBP1的过表达略微增加了HSP90的总量（图5e）。然而，用CHX抑制蛋白质合成后，当CircSHKBP1过表达时，HSP90的降解被显著抑制（图5h）。E3泛素连接酶STUB1已被证明泛素化HSP90。因此，我们使用蛋白酶体抑制剂MG132来阻断HSP90的泛素化。在MG132处理下，HSP90的降解减慢（图5i）。IP分析显示过表达CircSHKBP1降低了与HSP90结合的STUB1数量（图5j和k）。此外，HSP90的选择性抑制剂NMS-E973在体外损害了CircSHKBP1circhkbp1的促肿瘤功能（图5l-n）。这些结果表明，circSHKBP1直接与HSP90结合，通过STUB1抑制HSP90的泛素化，从而促进GC的发育。

6.CircSHKBP1促进体内GC生长
        我们构建了沉默和过表达CircSHKBP1的细胞株。将LV3-sh1、LV3-sh2和LV3-NC细胞接种于裸鼠右大腿皮下。结果表明，在肿瘤体积和肿瘤重量/体重比方面，LV3-sh1细胞的肿瘤明显小于LV3-NC细胞（图6a，b）。另外，我们将LV5- CircSHKBP1和LV5-NC细胞接种于裸鼠右大腿皮下，每组半数小鼠每周给予贝伐单抗两次。经过21天的监测，来自LV5- CircSHKBP1细胞的肿瘤比来自LV5-NC细胞的肿瘤体积更大、重量更重。此外，贝伐单抗显著抑制肿瘤生长（图6c，d）。通过对小鼠血清和肿瘤中的蛋白质进行WB分析，我们发现，与LV3-NC组相比，LV3-sh1和LV3-sh2组的HUR和VEGF水平降低（图6g和h）；与LV5-NC组相比，LV5- CircSHKBP1组的HUR和VEGF增加，而VEGF被贝伐单抗抑制（图6e和f）。肿瘤组织中HUR和VEGF的IHC结果相似（图6i-l）。接下来，我们从血清外泌体和肿瘤中提取总RNA，用qRT-PCR方法研究circSHKBP1。结果表明，外泌体circSHKBP1的表达与癌组织CircSHKBP1的表达呈线性关系（图6m）。我们还测量了肿瘤中miR-582-3p的水平，发现它与circSHKBP1的水平呈负相关（图6n）。此外，CD31在肿瘤中的IF显示LV5-circSHKBP1组的荧光区明显大于对照组（图6o和p），表明血管生成活跃。

7.CircSHKBP1促进体内GC转移
        为了研究circSHKBP1在体内的转移潜能，我们首先用荧光素酶质粒稳定转染上述5种细胞系，然后通过尾静脉注射到裸鼠体内。LV5- circSHKBP1和LV5-NC组半数小鼠每周给药两次贝伐单抗。结果表明，circSHKBP1基因敲除可显著减少肺转移病灶的数量和大小（图7a-c）。此外，IHC显示circSHKBP1敲低导致GC肺转移灶HUR和VEGF染色明显减少（图7d）。生物发光成像和HE染色显示，circSHKBP1的过表达加重了肺转移病灶，HUR和VEGF染色增加（图7e-h）。贝伐单抗也能抑制circSHKBP1的转移潜能。

结 论：
        总之，我们证明circSHKBP1在GC患者中上调，并与TNM分期、血管侵犯和不良预后有关。以circSHKBP1为靶点的血清外泌体液体活检可以帮助诊断和预测胃癌的进展。CircSHKBP1通过吸收miR-582-3p来上调HUR和VEGF，并通过与STUB1竞争来诱导HSP90，从而促进GC进程。因此circSHKBP1被认为是一种很有前途的胃癌诊断和预后的生物标志物，是胃癌治疗的潜在治疗靶点。