外泌体lncRNA作为胃癌早期检测和监测进展的生物标志物

    胃癌(gastric cancer, GC)相关长链非编码RNA1 (lncRNA-GC1)在胃癌发生中起重要作用。然而，外泌体lncRNA-GC1及其在GC中的潜在作用尚不清楚。近期，来自中国人民解放军综合医院的陈林团队发表在JAMA Surgery上的一篇论文发现lncRNA-GC1存在于从胃癌患者血清样本中分离的外泌体中，并系统地研究了外泌体lncRNA-GC1在健康供体(HD)、早期胃癌患者(EGC)和胃癌前病变患者中的表达。更重要的是，他们比较了lncRNA-GC1与标准生物标志物CEA、CA72-4、CA19-9的诊断效率。结果表明循环外泌体lncRNA-GC1可作为检测早期GC和监测疾病进展的非侵入性生物标志物。内镜联合循环外泌体lncRNA-GC1检测可以提高胃癌的早期诊断率。

技术路线：

研究结果：
1.在测试阶段和GC细胞系中外泌体lncRNA-GC1的水平
    从患者血清或条件培养的GC细胞(GGCs)中分离外泌体。在测试阶段，GC患者(96例)外周血外泌体lncRNA-GC1和血清CEA水平明显高于HD 组(68例) (图2A和B)。同样，GC患者血清中CA72-4和CA19-9水平高于HD组 (图2 C和D)。此外，循环外泌体lncRNA-GC1曲线下面积(AUC)值高于CEA、CA72-4、CA19-9的AUC值。lncRNA-GC1的敏感性和特异性也高于CEA、CA72-4、CA19-9。此外，10种不同GGCs培养基中的lncRNA-GC1外泌体水平明显高于GES -1细胞和原代胃上皮细胞(PGECs)。这些结果表明，与标准的GC标记相比，循环外泌体lncRNA- GC1可能是GC特异性的lncRNA。

2.EGC中循环外泌体lncRNA-GC1的验证
    在验证阶段，GC患者循环外泌体lncRNAGC1水平明显高于CAG患者、IM患者、HP阳性健康者和HP阴性健康者 (图3)。4个对照组(CAG、IM、HP阳性、HP阴性)无统计学差异。胃癌患者CEA、CA72-4、CA19-9水平高于CAG、IM、HP阳性、HP阴性。循环外泌体lncRNA-GC1在鉴别胃癌与HD及胃癌前病变患者时的AUC值、敏感性、特异性均高于CEA、CA72-4、CA19-9。进一步评估lncRNAGC1对胃癌早期检测的诊断价值时，发现与HDs、CAG、IM患者相比，I期和II期胃癌患者循环外泌体lncRNA-GC1水平显著升高(图3 C)。然而，I期或II期胃癌患者的CEA、CA72-4和CA19-9水平与HD相似。将测试和验证阶段的GC患者一起比较，GC和EGC的循环外泌体lncRNAGC1的水平仍然比HD和癌前对照患者的水平高(图4A)。3个标准生物标志物的水平仍然不能区分EGC和HD。ROC曲线显示，与CEA、CA72-4、CA19-9相比，lncRNA-GC1在区分EGC与HD、CAG或IM患者时具有更高的AUC值、敏感性和特异性(图4B)。此外，lncRNA-GC1对于鉴别GC，尤其是EGC仍具有较高的诊断效率，而CEA、CA72-4、CA19-9与HD呈阴性(图4C)。这些结果强烈表明循环外泌体lncRNA-GC1水平对早期GC的检测具有重要的诊断价值。

3.外体lncRNA-GC1水平在监测GC进展中的应用
    为了确定lncRNA-GC1水平是否与GC的进展相关，在验证阶段，分析了不同TNM分期和分化分级患者循环外泌体lncRNA-GC1水平。循环外泌体lncRNA-GC1水平随着临床I期至IV期的升高而递增，且4个时期临床与HD都有显著差异(图5)。其次，循环外泌体lncRNA-GC1水平与HD相比均随T期和N期而升高，从T1期至T4期、N0期至N3期呈递增趋势(图5 B和C)。与HD相比，循环外泌体lncRNA-GC1水平在病理分级上保持较高水平。但是GC分级的G1与G3之间无显著性差异(图5D)。肠型或弥漫型(Lauren分型)胃癌循环外泌体lncRNA-GC1水平高于HD。然而，肠道型和弥漫性无显著差异。
    为了研究原发性诊断期间及术后时间外泌体lncRNA-GC1水平的变化，进一步分析了补充阶段胃癌患者术前及术后5天的40对配对血清样本。35例患者术后血清中循环外泌体lncRNA-GC1水平较术前显著降低 (图4 D)。这些结果表明，与肿瘤负荷密切相关的循环外泌体lncRNA-GC1水平随着胃癌从早期到晚期的进展而显著升高，且与肿瘤分化和Lauren分类无关。

4.lncRNA-GC1在GC和GGCs患者中的平行表达
    虽然胃癌患者循环外泌体lncRNA-GC1水平较高，但确定其与胃癌肿瘤组织的水平是否一致是很重要的。因此，分析了40例胃癌组织、癌旁非癌组织以及同一患者血清外泌体中lncRNA-GC1的水平。在40个胃癌组织中，检测到36个癌组织和外泌体中lncRNA-GC1的水平高于相应的癌旁非癌组织。此外，10个GGCs的lncRNA-GC1表达水平高于GES -1细胞和PGECs， 10个GGCs的培养液中lncRNA-GC1的外泌体表达水平高于GES -1细胞和PGECs。综上所述，这些结果表明lncRNA- GC1的外泌体水平与胃癌组织一致，是一种GC特异性的lncRNA。
5. GC患者循环外泌体lncRNA-GC1的稳定性
    血清中lncRNA的不稳定性仍然是临床应用的主要限制。因此，随机收集15份GC血清样本，研究lncRNA-GC1的稳定性。RNase处理后lncRNA-GC1在血清中的表达水平保持稳定。此外，长期暴露于室温和反复冻融对lncRNA-GC1的血清水平无影响。lncRNAGC1的外泌体血清水平与lncRNA-GC1总血清水平相关。综上所述，这些结果表明lncRNA-GC1几乎全部被包裹在外泌体中，从而得到保护，使lncRNA-GC1具有足够的稳定性，可用于临床试验。
参考文献：
Guo, X., Lv, X., Ru, Y., Zhou, F., Wang, N., Xi, H., Zhang, K., Li, J., Chang, R., Xie, T., Wang, X., Li, B., Chen, Y., Yang, Y., Chen, L., & Chen, L. (2020). Circulating Exosomal Gastric Cancer-Associated Long Noncoding RNA1 as a Biomarker for Early Detection and Monitoring Progression of Gastric Cancer: A Multiphase Study. JAMA surgery, 155(7), 572–579. Advance online publication. https://doi.org/10.1001/jamasurg.2020.1133