lincNMR，癌细胞增殖与衰老命运的谱写者

    长链非编码RNA(lncRNA)是一类转录本长度不超过200nt的RNA分子，通常认为不编码蛋白质，而是以RNA的形式在多种层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）参与蛋白质编码基因调控。近些年研究发现，lncRNA可以作为致癌或抑癌基因参与肿瘤的发生发展，有望成为新型肿瘤标志物和肿瘤治疗的靶点。最近，德国癌症研究中心的Sven Diederichs教授及其团队研究发现LincNMR通过YBX1-RRM2调控轴影响肝癌细胞活力、增殖、衰老以及体内肿瘤的形成和生长，相关研究结果以“The lncRNA lincNMR regulates nucleotide metabolism via a YBX1-RRM2 axis in cancer”为题发表在Nature Communications杂志上，杂志影响因子为12.121。

研究思路：

结果：
1.lincNMR在肝细胞癌中的作用
    作者通过TCGA数据库筛选了9个lncRNA，并在肝细胞癌中利用siPOOLs进行基于RNAi的表型分析，通过测定肝细胞癌中ATP含量，发现转录本RP6-65G23.3产生了最强的细胞活力下降，可与PLK134或HULC35敲低的效果相比较，命名为lncRNA lincNMR（a）。BrdU检测发现lincNMR沉默导致四个肝细胞癌细胞系的细胞增殖减少30%-80%（b），而lincNMR过表达挽救了因其沉默而导致的增殖减少（c）。此外，使用流式细胞仪进行细胞周期分析发现，lincNMR沉默后多个细胞系中处于细胞周期G0/G1期的细胞数量增加（d）。SA-β-GAL实验中，β-GAL阳性蓝色细胞在lincNMR缺失的细胞系的增多表明其沉默诱导细胞衰老（e，f）。以上研究结果说明lincNMR在肝癌细胞增殖过程中有重要作用。

2.lincNMR表达特征和在肿瘤生长中的作用
    进一步研究发现多种类型的肿瘤组织和正常组织中lincNMR表达具有显著性差异（a）。通过建立鸡绒毛膜尿囊膜异种移植模型发现lincNMR沉默模型肿瘤尺寸和重量明显小于对照组(b-d)。

3.lincNMR与YBX1的调控关系
    通过RAP和蛋白质谱分析，48个蛋白质被显著富集，22个候选蛋白质与肝癌病人的总生存显著相关（a,b），其中，YBX1与生存率有很强的相关性。利用RBPmap43软件预测发现lincNMR转录本有3个YBX1和两个SRSF3结合位点，且YBX1三个预测结果的第一个位点突变消除野生型lincNMR增殖挽救实验的效果（c），UV–RIP、RT-qPCR等实验证实lincNMR与YBX1蛋白的联系（d），YBX1沉默细胞增殖受损50%（e）。利用荧光素酶检测肝癌细胞株lincNNMR沉默后的YBX1活性，发现YBX1活性显著降低（f），而YBX1过表达挽救了部分因lincNMR沉默导致的增殖损伤（g）。以上数据说明lincNMR与YBX1相互作用并调节YBX1，且YBX1模拟了lincNMR对细胞增殖的影响，而YBX1对lincNMR的调控产生了一个前馈回路作用。

4.lincNMR与YBX1的靶基因
    lincNMR沉默后，RRM2、TK1、TYMS和其他的一些核苷酸代谢途径中的关键酶等蛋白表达强下调（a,b），且WB和SILAC-MS证实了RRM2、TK1和TYMS蛋白表达的降低（c,d），而YBX1缺失也诱导了RRM2、TK1和TYMS蛋白表达的显著性降低（e,f）。

    通过siPOOLs实验发现RRM2、TK1和TYMS的缺失显著损害了细胞的增殖，模拟了lincNMR缺失后观察到的表型（a），而RRM2抑制剂诱导细胞周期进程在G1期停止（lincNMR沉默效果类似）（b）。此外，YBX1、TK1或TYMS沉默显著诱导了细胞衰老（c,d）,并显著抑制了肝癌细胞的克隆生成能力，而RRM2缺失后，未留下任何阻止衰老或克隆生成的细胞（e,f）。以上结果说明lincNMR、YBX1、RRM2、TK1 和TYMS之间存在相互作用。

5.lincNMR/YBX1/RRM2/TK1/TYMS调控网络
    TCGA数据库肝癌样本分析显示YBX1 mRNA的表达与RRM2、TK1和TYMS mRNA表达呈显著正相关（a-c），Chip显示YBX1蛋白与RRM2、TK1和TYMS基因的启动子区域相互作用（d），且荧光素酶实验检测到RRM2、TK1和TYMS基因的启动子区域融合到荧光素酶，而lincNMR或YBX1沉默显著降低了三个启动子的荧光素酶活动（e）。以上结果进一步证明了lincNMR、YBX1、RRM2、TK1和TYMS的调控作用。

6.lincNMR缺失诱导dNTP水平降低
    由于lincNMR缺失导致dNTP合成酶下调，进一步研究了dNTPs水平是否会受到影响。通过siPOOLs沉默lincNMR发现dATP、dCTP、dGTP和dTTP显著性下调（a,b），而YBX1沉默也导致了四种dNTPs水平降低（c,d）。通过对lincNMR沉默的细胞提供额外的dNTPs挽救了lincNMR对细胞增殖的影响（e,f）。以上结果说明核苷酸代谢在lincNMR促增殖功能中的重要作用。

7.lincNMR调控机制图

结论：
    综上所述，作者确定了肿瘤促进lincRNA - lincNMR，并揭示了lincNMR/YBX1-RRM2/TK1/TYMS轴调控核苷酸代谢和调控肝癌细胞增殖与衰老命运的机制。
参考文献：
Minakshi Gandhi, Matthias Groß, Jessica M. Holler, et al. The lncRNA lincNMR regulates nucleotide metabolism via a YBX1 - RRM2 axis in cancer. Nature Communications. 2020.