Bmi-1与胃癌进展

    我们先前报道了Bmi-1与Raf激酶抑制蛋白（RKIP）之间的反向关系，这与胃癌（GC）的预后有关。今天小编为大家带来发表于“molecular cancer”上的文章“Bmi-1-induced miR-27a and miR-155 promote tumor metastasis and chemoresistance by targeting RKIP in gastric cancer”，向大家介绍Bmi-1调控胃癌发展的机制。

    在本研究中，我们首先进行微阵列分析以确定在Bmi-1过表达的细胞中差异表达的miRNA谱。然后，鉴定出能够调控RKIP的miRNA，通过qRT-PCR和Western blot检测Bmi-1、miR-155、miR-27a和RKIP的表达，并通过荧光素酶报告实验、qRT-PCR和Western blot证实了RKIP是miR-27a和miR-155的靶点。最后，我们研究了Bmi-1/miR-27a/RKIP和Bmi-1/miR-155/RKIP轴对肿瘤生长、增殖、迁移、侵袭、集落形成能力、转移和耐药的影响。
结果：
1.候选miRNA可能受Bmi-1表达的影响
    为了确定miRNAs是否参与了Bmi-1抑制RKIP，我们比较了Bmi-1异位表达（GES-1-Bmi-1）的细胞和对照细胞（GES-1）的miRNA表达谱。微阵列分析表明GES-1-Bmi-1细胞（图1a）中有51个上调和72个下调的miRNAs，包括miR-27a、miR-155和miR-516。在所有差异上调的miRNAs中，miR-27a、miR-761、miR-155、miR-4725、miR-4784、miR-4329、miR-4765和miR516b被预测为靶向RKIP（图1b）。我们选择miR-27a和miR-155，并通过qRT-PCR证实它们在GES-Bmi-1细胞中上调（图1c）。当Bmi-1基因在BGC823和SGC7901 GC细胞系中被敲除时，miR-27a和miR-155被下调（图1d）。
    接着，为了探讨Bmi-1、miR-27a、miR-155和RKIP在GC中的临床意义，我们首先用qRT-PCR分析了它们的RNA表达水平。结果显示，在GC组织中Bmi-1、miR-27a和miR-155表达较高，而RKIP表达较低（图1e）。此外，Bmi-1、miR-27a和miR-155高表达和RKIP低表达的患者在肠型GC中的3年总生存率较短。上述四项指标与弥散型胃癌的3年总生存率无显著相关性（图1f）。综上所述，我们的结果显示Bmi-1、miR-27a和miR-155在GC中升高，与GC预后不良有关，而RKIP在GC中的表达水平较低，与预后良好相关。

2.miR-27a和miR-155负调控RKIP的表达
    如图2a和b所示，miR-27a和miR-155显著降低含有RKIP 3'UTR质粒的荧光素酶活性。此外，RNA EMSAs证实miR-27a与其同源的RKIP靶序列直接相互作用，但miR155没有观察到这种相互作用。如图2c所示，miR-27a及其同源的RKIP mRNA寡核苷酸可结合在一起形成稳定的miRNA/mRNA复合物。然而，miR-155在不同的迁移率下显示出两条带，表明miR-155没有与RKIP mRNA的寡核苷酸结合形成稳定的复合物（图2d）。此外，miR-27a/RKIP mRNA复合物能够与SGC7901细胞质提取物相互作用，形成新的复合物（图2e）。为了探讨miR-27a和miR-155在RKIP表达中的作用，在转染miR-27a模拟物/抑制剂或miR-155模拟物/抑制剂后，对BGC823和SGC7901 GC细胞进行了Western blot分析和相应的密度分析。结果表明，miR-27a和miR-155模拟组的RKIP蛋白表达降低，而miR-27a和miR-155抑制剂组的表达增加与（图2f）。然而，转染miRNAs后RKIP的RNA表达没有改变（图2g）。

3.Bmi-1通过miR-27a和miR-155调控RKIP的表达
    为了证实Bmi-1对RKIP的调节作用是通过miR-27a和miR-155介导的，我们将miR-27a抑制剂和miR-155抑制剂引入GC细胞中。转染Bmi-1后，BGC823和SGC7901细胞中RKIP的蛋白表达显著降低，但miR-27a和miR-155抑制剂都能恢复RKIP的表达。与此相反，在转染siBmi-1后，RKIP在BGC823和SGC7901细胞显著增加，miR-27a模拟物和miR-155模拟物抑制了RKIP表达（图3a）。此外，转染miRNAs或siBmi-1后，RKIP的RNA表达没有改变（图3b）。总的来说，这些发现表明RKIP的表达受到Bmi-1通过miR-27a和miR-155的负调控。

4.在体外，Bmi-1通过miR-155和miR-27a调节细胞迁移、侵袭、增殖和化疗敏感性
    我们通过Transwell法检测BGC823和SGC7901细胞的迁移和侵袭行为。我们发现，与模拟对照组相比，Bmi-1基因敲除减少了迁移和侵袭细胞的数量，而miR27a或miR-155的共转染增加了这些细胞的数量（图4a）。MTS实验表明miR-27a和miR-155的过表达导致细胞增殖的增加，而Bmi-1的下调抑制了细胞增殖，这可以通过miR-27a或miR-155的共转染来抵消（图4b）。菌落形成试验表明，与阴性对照相比，Bmi-1被抑制时，菌落形成较少。然而，miR-27a或miR-155的共转染逆转了菌落形成能力的降低（图4c）。接着，用MTS法检测肿瘤细胞对化疗的敏感性，当使用两种常规化疗药物治疗时，Bmi -1基因敲除细胞表现出比对照组细胞更少的化疗耐药性。此外，为了确定Bmi-1在药物治疗过程中是否通过miR-27a或miR-155在细胞凋亡中起重要作用，我们还将miR-27a模拟物和miR-155模拟物转染到shBmi-1细胞中。我们发现miR-27a和miR-155显著减弱Bmi-1沉默对药物诱导的细胞凋亡的影响（图4d）。因此，可以推断Bmi-1通过miRNA依赖机制部分调节化疗敏感性。

5.Bmi-1基因敲除通过miR-27a和miR-155抑制肿瘤生长、转移和耐药
    为了验证Bmi-1和miR-27a/ miR-155在肿瘤生长、转移定植和耐药中的作用，将BGC823-NC模拟物、BGC823-miR-155模拟物、BGC823-miR-155模拟物、BGC823-miR-27a模拟物、BGC823-miR-27a模拟物、BGC823-shbc-1、BGC823-shBmi-1、BGC823-shcon+NC模拟物、BGC823shBmi-1+miR-155模拟物和BGC823-shBmi-1+miR27a模拟物细胞皮下或静脉注射入裸鼠体内。注射shBmi-1的小鼠肿瘤生长明显减弱，而注射miR-155模拟物或miR-27a模拟物的小鼠则显示相反的效果，并且肿瘤生长增加（图5a-c）。免疫组化结果也证实了这一点（图5d）。正如预期的，我们观察到BGC823 shBmi-1组比对照组有更少的肺和肝转移。我们还注意到，BGC823 miR-27a模拟组和BGC823-miR-155模拟组在肺和肝脏的转移灶数量都有显著增加。此外，与BGC823shBmi-1+miR-155模拟细胞或BGC823shBmi-1+miR-27a模拟细胞相比，小鼠肺部和肝脏中的病灶数量显著上调（图6a-c）。
    为了评估肿瘤细胞的化疗敏感性，我们建立了皮下异种移植，然后评估了它们对5-Fu治疗的反应。治疗14天后，处死小鼠，并肿瘤切除并称重。结果表明，与对照组相比，miR-155模拟组和miR-27a模拟组的肿瘤明显大于对照组，显示出对5-Fu的耐受性（图6d-f）。然而，与对照组相比，shBmi-1在抑制肿瘤生长和提高对5-Fu的敏感性方面表现出明显更强的作用。值得注意的是，与shBmi-1+miR-155模拟物或shBmi-1+miR-27a模拟物共转染组的肿瘤比shBmi-1组的肿瘤生长快得多，这表明miR-155模拟物和miR-27a模拟物能够降低BGC823细胞对5-Fu的敏感性（图6g-i）。总的来说，shBmi-1的作用可以通过miR-27a模拟物或miR-155模拟物的作用来降低RKIP的表达。

结论：
    综上所述，本研究表明Bmi-1 通过miR-27a和miR-155对胃癌转移抑制基因RKIP产生负调控作用。此外，由于Bmi-1/miR-27a/RKIP和Bmi-1/miR-155/RKIP信号轴在肿瘤转移和耐药中扮演重要角色，它们可能成为新的胃癌治疗方法的有效靶点。