miR-541增强索拉非尼对肝癌的疗效

    肝细胞癌(HCC)严重威胁着人类健康。索拉非尼是一种被批准为治疗晚期HCC的一线系统性靶向药物，但治疗耐药性降低了其临床疗效。自噬在HCC中也发挥促进肿瘤发生、维持肿瘤生长、增强转移的作用。靶向自噬相关基因的miRNAs的失调可能导致索拉非尼耐药，促进HCC细胞的生长。基于以上研究背景，大海军医大学Wen-Ping Xu等人在Hepatology杂志上发表文章，研究miR-541在肝癌治疗中的作用。

技术路线图：

研究结果：
1.miR-541的下调与肝癌患者短生存期和高复发率相关
    首先查阅miR-541在HCC患者中的预后价值(搜索www.kmplot.com)。miR-541水平越低，HCC患者的总生存期(OS)越短(图1A)。RT-PCR检测发现肿瘤组织中miR-541的表达显著降低(图1B)。HCC样本中低水平的miR-541也与HCC患者较短的OS相关(图1D)。低miR-541表达组的复发率明显高于高miR-541表达组(48.4% vs 27.2%， p=0.029;图1E)。结果表明miR-541的表达在临床上与癌症复发和患者预后相关。

2. 在体内外，miR-541抑制肝癌细胞HCC的恶性表型
    过表达miR-541可显著抑制体外HCC细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭(图2A-E)。相反，抑制miR-541会增加HCC细胞的恶性表型(图2A-E)。此外，Ad-miR-541(过表达miR-541的腺病毒)组的移植瘤小鼠肿瘤生长和肿瘤重量显著降低(图2F-H)。细胞移植4周后的体外成像显示，Ad-Max组老鼠在5只（共9只）小鼠骨头中检测到荧光，但是Ad-miR-541组在2只（共9只）小鼠骨头中检测到荧光(图2 I和J)。在Ad-Max组的9只小鼠中有3只在肺中检测到荧光素酶信号，而在Ad-miR-541组的10只小鼠中只有1只检测到荧光素酶信号(图2 I和J)。组织学分析证实Ad-miR-541组在骨骼和肺部有较小的肿瘤病灶(图2K)。这些数据表明miR-541在HCC中具有强大的肿瘤抑制作用。

3. 在体内外，miR-541抑制肝癌细胞自噬
    LC3 I转变为LC3 II是自噬的一个标志。P62是自噬通量被抑制时细胞内积累的自噬受体。miR-541过表达降低了HCC细胞中LC3 II的水平，增强了P62的水平。相反，抑制miR-541可增加HCC细胞中LC3 II的水平，降低P62的表达(图3A)。免疫化学染色显示, Ad-miR-541处理的皮下异种移植中，LC3阳性肿瘤细胞较少，P62阳性肿瘤细胞较多(图3B和C)。TEM显示Ad-miR-541减少了肝癌细胞的自噬小体数量(图3 D和E)。使用mRFP-GFP-LC3报告基因构建的活细胞成像显示，自噬通量的比率在miR-541过表达时显著受到抑制，而在miR-541过表达时增强(图3F和G).

4. ATG2A和RAB1B是miR-541的两个直接靶点
    Targetscan, miRDB, microRNA.org, DIANA-microT, TARGETMINER和RNA22,暗示miRNA-541和ATG2A,RAB1B之间的相互作用 (图4 A和B),这些是自噬功能重要的调控作用。在过表达miRNA-541的肝癌细胞中，ATG2A 和RAB1B 的mRNAs和蛋白水平降低。miRNA-541抑制剂增加其表达(图4 C和D)。ATG2A mRNA 3’UTR中mir-541的两个结合位点和RAB1B mRNA 3’UTR中miR-541的四个潜在结合位点(图4 A和B)。荧光素酶标记实验显示ATG2A和RAB1B 3’ UTR是miR-541的直接靶标(图4 E, F)。此外,WB和IHC发现,在人类肝癌样本中,miR-541水平的增加伴随着ATG2A和RAB1B蛋白质表达减少(图4 G和H)。并且ATG2A和RAB1B的水平与miR-541水平负相关。 (图4I和J)。

5.在肝癌细胞HCC中，ATG2A和RAB1B促进癌症和自噬
    生存曲线显示ATG2A和RAB1B mRNAs的高表达与较差的预后相关，这与miR-541的临床意义相反(图5A和B)。siATG2A和 siRAB1B抑制增殖,集落形成,肝癌细胞的迁移和入侵(图5C-I)。此外,siATG2A和siRAB1B降低 LC3 II的水平,增加了肝癌细胞中P62表达 (图5J)和阻止自噬小体合成(图5 K和L)。这些结果表明ATG2A和RAB1B是肝癌细胞自噬的癌基因和阳性调节因子。

6. miR-541通过下调ATG2A和RAB1B抑制HCC的进展和自噬
    在转染siATA2A和siRAB1B的细胞中，miR-541抑制剂增加HCC细胞的增殖、迁移和侵袭的作用显著降低(图6A-F)。miR - 541抑制剂在促进自噬中的作用也被siATG2A和siRAB1B逆转了(图6 G和H)。总的来说,ATG2A和RAB1B的下调至少在一定程度上有助于影响miR-541在肝癌细胞中的作用。

7.在体内外，miR-541增强索拉非尼诱导的肝癌细胞死亡
    自噬加重索拉非尼耐药。Kaplan-Meier生存分析显示，高miR-541水平的HCC患者受益于索拉非尼治疗，而低miR-541表达的患者则不受益(图7A)。此外，转染miR-541 mimic的HCC细胞比对照细胞对索拉非尼更敏感，而转染miR-541 inhibitor的细胞对索拉非尼更耐药（IC50结果）(图7B-E)。Ad-miR-541和索拉非尼都抑制了肿瘤的生长、体积和重量(图7F和H)。IHC染色显示， Ad-miR-541或索拉非尼处理的肿瘤中Ki-67阳性细胞数量减少，而Ad-miR-541和索拉非尼联合处理的肿瘤中Ki-67水平进一步降低(图7I)。此外， Ad-miR-541或Ad-miR-541联合索拉非尼治疗可导致ATG2A和RAB1B表达明显下降，而索拉非尼治疗可导致ATG2A和RAB1B表达升高(图7I)。总的来说，索拉非尼对HCC生长的抑制作用可通过miR-541增强，这至少部分归因于其对ATG2A和RAB1B表达的调控作用。

总结：
研究强调了miR-541在HCC中的生物学意义，并阐明了其在HCC病程中的分子机制。
研究为HCC的个体化治疗提供了三个新的治疗靶点和预后标记。
本研究的结果将有益于肝癌的治疗。