CircCDK14，骨关节炎缓和因子

    骨关节炎（OA）是一种慢性退行性关节疾病，最常见于老年人，是世界范围内致残的主要原因。大量的危险因素已被证明与骨关节炎的进展有关，包括衰老、性别、肥胖、遗传、关节松弛、肌肉无力和既往的关节损伤。尽管骨关节炎对经济和社会的影响越来越大，但对其发病机理的深入了解仍然是难以捉摸的。以往研究表明，circRNA 和miRNA在炎症缓和中具有重要作用，可能是治疗骨关节炎的新型研究靶点。近期，浙江大学医学院附属邵逸夫医院赵兴博士的团队发现miR-125a-5p下调Smad2的表达，诱导TGF-β信号通路障碍，而CircCDK14能够作为miR-125a-5p的海绵促进Smad2的表达缓和骨关节炎，相关研究结果以“CircCDK14 protects against Osteoarthritis by sponging miR-125a-5p and promoting the expression of Smad2”为题发表在Theranostics杂志上，杂志影响因子8.579。
研究思路：
1.根据测序结果筛选在骨关节炎组织中表达下调的circRNA（CircCDK14），并在软骨细胞中进行表征；
2.探讨所选CircCDK14在软骨细胞细胞外基质（ECM）代谢、细胞增殖和细胞凋亡中的作用；
3.研究CircCDK14的ceRNA机制，以及相关靶点在骨关节炎中的作用；
4.探讨CircCDK14/miR-125a-5p/Smad2在兔模型中的作用。
结果：
1.CircCDK14在骨关节炎中的表达特征
    作者通过之前的测序结果发现CircCDK14在骨关节炎组织中显著下调（A），进一步研究发现15个人类软骨样本中CircCDK14在关节承重区域显著下调（B-D）。通过体外培养骨关节炎人群的软骨细胞，并添加IL-1β、LPS 或TNF-α模拟骨关节炎微环境，发现在添加IL-1β、LPS 或TNF-α后CircCDK14表达大幅度减少（E）。作者利用Sanger测序确定了CircCDK14是头到尾剪接（F），并利用引物确定CircCDK14的环状结构（G），且RNA酶 R处理后因其共价闭环结构不被降解（H）。荧光原位杂交发现CircCDK14主要定位于细胞质。以上结果说明CircCDK14主要表达于细胞质中，在关节承重区域显著性低表达。

2.CircCDK14在软骨细胞细胞外基质（ECM）代谢、细胞增殖和细胞凋亡中的作用
    作者通过siRNA沉默软骨细胞中CircCDK14的表达，并利用WB、qRT-PCR、IF实验发现CircCDK14沉默能后促进MMP3和MMP13的表达，抑制Sox9和Collagen II的表达（A-D），且能减弱人类软骨细胞增殖（F）。流式细胞术分析发现CircCDK14沉默显著增加了细胞凋亡的比率（E）。

    通过WB、qRT-PCR、IF实验发现过表达CircCDK14能够抵消用IF-1β处理对促进MMP3和MMP13表达以及抑制Sox9和Collagen II表达的影响（A-D），且能使IL-1β处理后降低的增殖能力显著增强（E）。以上结果说明CircCDK14通过调节软骨细胞的增殖、凋亡和ECM代谢预防骨关节炎。

3. 人类软骨细胞中CircCDK14与miR-125a-5p的作用机制
    作者通过qRT- PCR发现与对照组相比，Ago2过表达组中被Ago2抗体拉下的内源性CircCDK14显著富集（A）。利用targetscan和rnahybrid预测可能的靶点miRNAs，其中12个miRNAs被重复筛选（B），pull-down实验发现miR-3137、miR- 1184、miR-125a-5p和miR-3074-5p被拉下来，荧光素酶检测结果显示只有miRNA-125a-5p降低了50%以上的荧光素酶活性（E），进一步研究发现miRNA-125a-5p过表达诱导Collagen II和Sox9表达下降，而MMP3和MMP13的表达没有改变（F）。通过构建荧光素酶报告系统，发现miR-125a-5p和CircCDK14能够结合（G，H），FISH结果表明miR-125a-5p主要分布在细胞质中（I）。这些结果证实了CircCDK14作为miR-125a-5p海绵发挥作用。

4. miR-125a-5p在骨关节炎中的作用
    作者通过FISH实验发现miR-125a-5p在关节承重区域显著性高表达（A），WB、qRT-PCR和IF表明miR-125a-5p过表达能够下调Collagen II和Sox9（B-C），细胞增殖实验表明miR-125a-5p的表达水平与细胞增殖能力呈负相关（D）。进一步研究发现miR-125a-5p抑制逆转了CircCDK14沉默对人类软骨细胞 ECM合成、细胞增殖和细胞凋亡的影响（E-H）。这些结果表明，miR-125a-5p是CircCDK14的重要下游靶点，同时在软骨细胞中发挥拮抗CircCDK14的作用。

5. CircCDK14/miR-125a-5p/Smad2轴
    通过Targetscan、Starbase、miRTarBase和MiRwalk预测软件筛选了12个可能的mRNA靶点（A），qRT-PCR结果显示DHX33、Smad2 和ATXN7L3在CircCDK14被下调后表达下调（B），其中只有Smad2对Sox9 和Collagen II有影响（C），且荧光素酶报告实验表明Smad2与miR-125a-5p能够结合(D-E)。WB和qRT-PCR实验结果表明CircCDK14沉默和miR-125a-5p过表达减弱了Smad2的表达，但miR-125a-5p抑制能够消除CircCDK14沉默诱导的影响（F-I）。以上结果说明Smad2是一个重要的下游靶点。

    作者发现Smad2在15名人类骨关节炎样本的关节承重区域明显低表达（A，B），利用siRNA下调Smad2的表达并通过WB、qRT-PCR和IF实验发现Smad2沉默显著性降低了软骨细胞中Sox9和Collagen II的表达（C-E），进一步研究发现Smad2沉默减弱了软骨细胞的细胞增殖能力（F）。通过WB和qRT-PCR实验发现Smad2过表达能消除CircCDK14沉默或者miR-125a-5p过表达对Sox9和Collagen II的影响（H）。综上所述，我们的结果显示Smad2是CircCDK14/miR-125a-5p轴的主要调节因子，其在软骨细胞中表现出与CircCDK14类似的功能。

6. CircCDK14在体内对骨关节炎的作用
    作者构建兔模型探讨CircCDK14在体内对骨关节炎的作用，FISH和qRT-PCR实验评估CircCDK14、miR-125a-5p和Smad2的过表达水平（A），番红O和固绿染色显示注射WT AAV CircCDK14后关节表面软骨层明显增厚，而miR-125a-5p过表达减弱了这一影响（B）。免疫组织化学和WB分析表明注射WT AAV CircCDK14后软骨细胞中MMP3和MMP13的表达下降，Smad2、Sox9和Collagen II的表达上升；miR-125a-5p过表达减弱Smad2、Sox9和Collagen II的表达，而增加了MMP3和MMP13的表达（C，E）。TUNEL染色实验表明细胞凋亡的结果与体外一致（D）。以上结果表明CircCDK14通过miR-125a-5p和Smad2的调节作用在体内行使功能。

结论：
    CircCDK14可以通过维持软骨ECM的合成代谢和抑制分解代谢来缓和骨关节炎，这一作用是通过CircCDK14/miR-125a-5p/Smad2调控轴调控的。

参考文献：
Panyang Shen, Yute Yang, Gang Liu, et al. CircCDK14 protects against Osteoarthritis by sponging miR-125a-5p and promoting the expression of Smad2. Theranostics. 2020, 10(20): 9113-9131.