惊呆你的骚操作——人尿来源外泌体保护肾脏缺血/再灌注损伤

    缺血/再灌注损伤（IRI）是急性肾损伤（AKI）的主要原因，与高发病率和高死亡率相关，缺乏专门的治疗方法。在这项研究中，调查了人类尿液来源干细胞（hUSCs）及其外泌体对IRI诱导的AKI的保护作用，以探索这些细胞作为新治疗策略的潜力。本文发表在Theranostics（IF:8.579）的2020年1021卷。
技术路线：

主要实验结果：
1、分离鉴定hUSCs
    如图1所示，从人类尿液样本中分离出细胞培养3-5天，观察到微小的纺锤状细胞集落，并能在体外迅速增殖，流式，WB和qRT-PCR检测了其表面分子的表达，包括OCT4和NANOG。

图1人类尿液来源干细胞的特性

2、在肾IRI模型中，USCs可减少肾小管损伤和细胞凋亡，抑制局部炎症
    与对照组相比，USC处理显著提高大鼠生存期，注射USCs后第3天sCr和BUN水平降低，第7天肾脏损伤病理评分降低。

图2 肾IRI后USCs对肾功能的保护作用

    随后，作者检测了USC处理的IRI小鼠模型肾脏细胞的凋亡，和炎症因子的表达情况，如图3所示，USC处理后细胞凋亡显著减少，炎症细胞的浸润显著下降，细胞的氧化应激水平也明显受到抑制。

图3 USCs降低IRI后肾脏凋亡相关蛋白表达、炎症细胞浸润和氧化应激水平

3、USC-Exo在体内对IRI有保护作用，在体外对H/R损伤后的HK-2细胞氧化应激有抑制作用
    为了探究USC处理对小鼠的保护作用是否通过外泌体发挥作用，作者从USC中提取了外泌体样本，如图4A所示。随后发现，与对照组相比，USC来源外泌体（USC-Exo）处理组显著提高了小鼠生存期，sCr和BUN水平降低。在体外H/R损伤后，使用USC-Exo处理组的HK2细胞的焦亡和炎症分子的表达显著下降，表明USC-Exo对HK2有保护作用。

图4 USC-Exo在体内对肾功能有保护作用，在体外对H/R损伤后的HK2细胞有保护作用

4、在USC-Exo中，miR-146a-5p抑制IRAK1的表达
    为了进一步探究USC-Exo的作用机制，作者进行了外泌体RNA测序，从而鉴定到20个候选的miRNA，其表达如图5A所示，挑选表达丰度最高的6个做了qRT-PCR验证，发现只有miR-146a-5p显著高表达。随后，进行了荧光素酶实验，结果显示miR-146a-5p与IRAK1具有物理结合作用。

图5 USC-Exo含量的miRNA测序及miR-146a-5p的潜在靶点

5、在体内和体外USC增强miR-146a-5p的表达和抑制IRAK1表达和NF -κB p65亚基的核异位
    为了进一步证实miR-146a-5p对于USC在IRI中的保护作用至关重要的假设，首先确定了USR治疗的IRI大鼠肾脏组织中miR-146a-5p的表达水平。 qRT-PCR分析显示，USC治疗的IRI组的肾脏中miR-146a-5p表达上调（图6A）。为了进一步确定USC分泌的miR-146a-5p是否通过外泌体递送到受损的肾脏组织，在USC处理后第3天从大鼠收集血清样品，提取外泌体，并检测miR-146a-5p的表达水平。结果显示与对照组比，外泌体miR-146a-5p在经USC治疗的血清组中表达更高（图6B）。FISH进一步证明了在受损的肾脏组织中miR-146a-5p表达的增加（图6C）。IRAK1的mRNA（图6A）和蛋白（图6D）表达水平在USC治疗的IRI大鼠的肾脏中被下调。USC-Exo处理可显着上调miR-146a-5p表达并下调IRAK1在HK2处理细胞中的表达（图6E）。与体内观察结果一致，WB显示，USC-Exo处理后IRAK1蛋白表达以及NF-κB p65亚基的核易位均降低（图6F）。进一步在USC-Exo处理的细胞中对NF-κB p65进行了染色，发现在H / R后的对照HK2细胞中，NF-κB p65位于细胞核中。相反，在H / R后经USC-Exo处理的HK2细胞中，一些NF-κB p65保留在细胞质中，其核定位水平显着降低（图6G）。这些结果表明，USC对肾损伤的保护作用可能是通过外泌体miR-146a-5p介导的NF-κB信号下调而发生的。

图6 USC或USC-Exo上调miR-146-5p表达抑制IRAK1和NF -κB信号体内和体外

6、针对H / R HK2细胞miR-146-5p抑制IRAK1表达式和NF -κB p65核易位
    接下来在体外使用H / R诱导的损伤模型描述miR-146a-5p和IRAK1之间的调控关系。用miR-146a-5p转染HK2细胞，并通过qRT-PCR证实了miR-146a-5p表达增加（图7A）。转染的细胞同时受到H / R损伤，qRT-PCR分析显示miR-146a-5p导致IRAK1 mRNA表达显着降低（图7A）。此外，用miR-146a-5p可以减少氧化应激，增加SOD活性，并降低MDA含量（图7B）。WB表明，miR-146a-5p导致IRAK1蛋白表达和NF-κB p65亚基核易位显着降低（图7C）。免疫荧光染色显示miR-146a-5p可以减少NF-κB p65的核定位（图7D）。而用miRNA抑制剂处理HK2细胞，发现抑制剂治疗组IRAK1的表达水平高于对照组（图7E）。 miR-146a-5p抑制剂可加重氧化应激，降低SOD活性，并增加MDA含量（图7F-G）。这些结果共同表明，miR-146a-5p在H / R诱导的损伤中调控IRAK1表达和NF-κBp65亚基核易位中具有不可或缺的作用。

图7 miR-146-5p减少氧化应激，抑制IRAK1，NF -κB信号在H/R-induced HK2细胞的损伤

    总而言之，本文证明了USC通过抗氧化，抗炎和抗凋亡细胞保护作用之间的相互作用，在IRI大鼠模型中预防肾脏损伤。 此外，在体外使用H / R诱导的氧化应激细胞模型，确定了USC-Exo中的关键参与者miR-146a-5p，它通过下调IRAK1 /NF-κB信号传导来介导细胞保护作用。这些发现为使用无创且经济高效的USC或USC-Exo治疗AKI提供了理论基础。
参考文献：
Li Xirui., Liao Jun., Su Xiaojun., Li Weiqiang., Bi Zirong., Wang Jiali., Su Qun., Huang Huiting., Wei Yongcheng., Gao Yifang., Li Jun., Liu Longshan., Wang Changxi.(2020). miR-146a-5pHuman urine-derived stem cells protect against renal ischemia/reperfusion injury in a rat model via exosomal  which targets . Theranostics, 10(21), 9561-9578. doi:10.7150/thno.42153