胆固醇积累减少角鲨烯环氧酶加速结直肠癌的进展和转移

近日Nam-Soon Kim等人发现，胆固醇积累导致的SQLE降低通过激活catenin致癌通路和p53抑癌通路失活，加重结直肠癌（CRC）进展。相关论文”Reduction of squalene epoxidase by cholesterol accumulation accelerates colorectal cancer progression and metastasis.”于2020年9月份发表在《Gastroenterology》杂志上。

结直肠癌(CRC)是全球第三大最常见的恶性肿瘤，大多数结直肠癌死亡与转移有关。一些报告支持了胆固醇和CRC之间的联系:风险的增加与饮食和血浆胆固醇的增加有关，而风险的降低与使用他汀抑制胆固醇合成有关。因此，胆固醇如何影响CRC值得进一步研究，并可能提供新的治疗机会。

为了获得完全的恶性表型，肿瘤细胞需要克服几个限制。其中包括:(1)癌基因诱导衰老(OIS)，这是一种不可逆的细胞周期阻滞，主要由肿瘤抑制网络的诱导引起;(2) anoikis，即细胞/细胞/基质相互作用被剥夺而导致的凋亡细胞死亡;以及(3)进行上皮-间充质转化(EMT)的需要。肿瘤干细胞(CSCs)和EMT在转移性CRC进展中相互交织，共同产生更大的异质性，从而加剧恶性肿瘤。迁移CSCs (MCSCs)是由静止CSCs通过瞬时EMT诱导产生的，具有干细胞性和侵袭性，这两种特性都是成功转移的原因。一项研究表明，CD110和CDCP1分别是MCSCs在结直肠肝转移和结直肠肺转移中的新标志物。角鲨烯环氧酶(SQLE)，又称角鲨烯单加氧酶，是一种胆固醇合成的调控酶，位于3-羟基-3-甲基戊二酸辅酶a还原酶(HMGCR)的下游。几项研究已经报道了SQLE作为一种真实的致癌基因存在于多种癌症类型中，包括乳腺癌和肝癌。据报道，在一系列乳腺和CRC细胞系中，除了在缺氧条件下促进癌细胞存活和增殖外，SQLE还与肿瘤驱动因子MYC共扩增。

   本文通过DNA微阵列在CRC相关基因筛选中发现了SQLE，并在此研究了CRC进展中SQLE减少的功能后果。我们发现，SQLE的减少通过结合衰老绕过、anoikis抵抗、EMT和MCSCs的产生，赋予肿瘤细胞侵袭性转移能力。

技术路线：

一、在侵袭性CRCs中，SQLE减少

   与正常组织比较，CRCs中SQLE显著上调而HMGCR下调(图1A-C)。

   高SQLE mRNA水平的CRC患者的中位生存至少比低SQLE水平的患者高80%(图1D-E)。

   SQLE的显著HR比率和E-cadherin的减少支持了高级别和高肿瘤 budding CRCs中，SQLE mRNA和蛋白水平显著降低，且有更大的转移倾向，这得到了显著的SQLE HR比率和E-cadherin降低的支持(图1F-J)。

   这些数据表明，SQLE减少是胃肠道肿瘤发展过程中一个独特的特征。

二、胆固醇积累通过降低SQLE加速肿瘤细胞的恶性转化和侵袭性

   如果这种胆固醇在CRC肿瘤中的积累可能是我们在侵袭性CRC中发现的SQLE减少的原因。因此，当胆固醇被添加到CRC细胞中时，由此导致的细胞胆固醇状态的升高(图2A)降低了SQLE水平(图2B-C)，这与其他细胞系一致。

   当用胆固醇、小干扰RNA对抗SQLE (siSQLE)或SQLE任务shRNA慢病毒转导颗粒(shSQLE)处理时，在模拟anoikis条件的超低亲和表面(ULA)培养的CRC细胞显示出更多的细胞聚集，表示细胞存活增加(图2D-E).

   侵袭性急剧增加，上皮标志物下调，间充质标志物上调(图2F-G)

   这些观察结果支持的异位表达SQLE减少β连环蛋白水平(图2 h)和增加的活动TCF / LEF转录因子家族,其次是归纳在锌指E-box-binding同源框1 (Zeb1 HCT116),肠道三叶草因素(也称为TFF3, ITF HT29)和β连环蛋白在SQLE-depleted条件下(图4 c, 5 c)。

这些数据表明，胆固醇依赖性的SQLE降低可促进细胞存活和侵袭性，可能是通过诱导EMT和CSCs。

三、SQLE的减少有助于癌细胞克服细胞内恶性转化的限制

   与对照组相比，，多色流式细胞术检测细胞凋亡率明显降低(Annexin V+)，胆固醇和sh/siSQLE-细胞凋亡中E-cadherin、p53和SQLE的水平(图3A-C)

   蛋白印迹(图3C)证实，在CRC细胞中，SQLE敲低与EMT同步激活有助于anoikis耐药，其支持的原因是SQLE的异位表达阻止了siSQLE导致的细胞生存表型增强(图3B-C，补充图7B-C)。

   SQLE耗尽超过OIS，表现为衰老相关的半乳糖苷酶(SA- gal)活性和G1停滞(图3D-E，补充图5E, 5K, 7D-E)。

   Ki-67阳性细胞的数量表明，这种抑制与细胞凋亡减少和增殖增加有关(图3F-G）。

   通过在CRC中诱导EMT，下调anoikis和OIS，降低SQLE可促进CRC细胞生存和增殖。

四、SQLE还原解离GSK3 p53与p53的相互作用，导致GSK3抑制抑制和p53降解，从而促进癌细胞存活

   值得注意的是，通过胆固醇处理可以观察到(图5A)， GSK3抑制剂CHIR99021明显上调了Mdm2和catenin水平，同时下调了p53(在p53的第15/20个丝氨酸处降低，磷酸化降低了p53对Mdm2的亲和力)，

同时抑制细胞凋亡，PARP裂解减少(图5B)。

   同时处理胆固醇和CHIR99021进一步提高了细胞存活率，随后分别通过诱导Zeb1和ITF提高了TCF/LEF的活性(图5C)。考虑到TCF/LEF和Zeb1的增加可增强细胞存活率29，我们的数据证实，在SQLE耗尽时，GSK3抑制对癌细胞存活是必要的。

   SQLE与活跃的GSK3的Tyr216相互作用，但不与不活跃的GSK3的cads9相互作用(图5D)。

   活性GSK3蛋白与SQLE的Nterminal胆固醇调节域相互作用，由融合到GFP10的前100个氨基酸组成(图5E)，但不单独与GFP相互作用(图5F)。

   在SQLE过表达细胞中观察到，GSK3的过表达增加了细胞中总胆固醇、酯化胆固醇和游离胆固醇的含量(图5G)。

   GSK3羟色胺的异位表达显著上调了内源性SQLE水平(图5H)，支持了GSK3抑制抑制降低SQLE水平的观点(图5B)。

   GSK3羟甲基丙烯酸酯似乎促进了SQLE在胆固醇生物合成中的作用，可能是通过增加其稳定性。

   我们没有观察到sq过表达HT29细胞中胆固醇水平的显著升高，可能是因为这些细胞中的p53R273H可能饱和了SQLE表达，进一步的SQLE过表达无法增加胆固醇含量(图5G)。

   总之，活性GSK3蛋白有助于SQLE的稳定性，从而增加细胞内胆固醇的产生;SQLE下调引起的GSK3抑制抑制下调p53抑癌通路，同时激活了catenin致癌通路，使癌细胞变为完全恶性。

六、持续的高血清总胆固醇水平和SQLE降低加重了CRC的侵袭性

   与对照组的shContmice相比，我们在高胆固醇方案的小鼠和注射shsq的对照组小鼠中检测到大量转移性扩散(通过活细胞信号强度的显著增加可以证明)(图6A-6C)

   体外成像证实，长期高血清总胆固醇水平或SQLE降低可使CRC细胞局部侵袭和转移到远处器官，特别是肺(图6D-F)

   小鼠相比，转移性扩散显著缩短了shCon小鼠的生存期(图6G)

   我们没有观察到HCT116 p53空细胞在小鼠中的转移性扩散(补充图12G-K, 13I-L)，这与siSQLE-HCT116 p53null细胞中减少的catenin和Zeb1/ITF表达相关(图4C)。

   这些数据表明，胆固醇积累以SQLE和p53依赖的方式增强转移性扩散并缩短CRC细胞的生存时间。

七、胆固醇的积累减少了SQLE丰度，产生迁移的癌症干细胞

   对单个器官，尤其是肺的病理分析显示，SQLE敲除和高胆固醇方案均可诱发具有未分化特性的固体、非包裹性肿瘤(图6F, 7A）

vimentin阳性强，caspase-3和组蛋白H2A免疫反应性低，可见这些肿瘤存活，并具有迁移/侵袭和增殖特征。与对照组饮食的shcon小鼠相比(图7B-D)

通过抑制anoikis和OIS，诱导EMT，高胆固醇支配和基因SQLE减少都加剧了CRC的侵袭性。

与转移增强相一致的是，shsqle小鼠和高胆固醇方案小鼠肺内的CDCP1均显著升高(图7E)

检测到在shsql小鼠和高胆固醇组小鼠的血液中，富含上皮细胞黏附分子(EpCaM)、CD110和CDCP1的细胞百分比急剧增加。这些富集的细胞也显示出SQLE表达的显著减少(图7F)

   总之，通过胆固醇积累降低SQLE在MCSCs的生成中起关键作用，MCSCs是肿瘤转移的关键驱动因素。