鸢尾素抑制脓毒症小鼠肝脏内铁死亡

研究背景：铁死亡是一种铁依赖的程序性细胞死亡，研究认为铁死亡与脓毒症的发病机制有关。运动中释放的肌动素鸢尾素在各种条件下都能改善线粒体功能。铁死亡与线粒体功能密切相关。然而，鸢尾素在脓毒症诱导的肝脏铁死亡和线粒体功能障碍中的作用尚不清楚。陕西省再生医学中心Shasha Wei在Clinical and Translational Medicine（IF=7.919）上发表文章，研究鸢尾素治疗对脓毒症患者的铁死亡的作用。

技术路线图：

研究结果：

1.脓毒症患者血清中鸢尾素水平与健康对照组比较

比较60名脓毒症患者和29名健康受试者，发现健康人体内鸢尾素水平高。脓毒症患者血清中鸢尾素水平与APACHE II评分（判断危重患者的病情严重程度）存在相关性。在脓毒症患者中，血清鸢尾素水平下降与疾病严重程度呈负相关。

Figure 1

2. 脓毒症动物模型血清中鸢尾素水平

与临床结果一致， CLP小鼠术后12H、24 h，血清鸢尾素水平显著降低(图2A)。在LPS诱导的小鼠中，血清鸢尾素水平也显著降低，且以LPS剂量依赖性下降(图2B)。鸢尾素主要在骨骼肌中表达，lps诱导的脓毒症小鼠骨骼肌中FNDC5 mRNA水平明显降低(图2C)，提示脓毒症小鼠骨骼肌中鸢尾素的表达减少。

Figure 2

3. 鸢尾素抑制CLP诱导的脓毒症老鼠的铁死亡

谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4)铁蛋白水平呈负相关。图3A和3B显示，术后24小时CLP小鼠肝脏GPX4水平明显降低。而鸢尾素治疗后CLP小鼠肝脏中GPX4表达明显升高(图3C,D)。GPX4的表达，谷胱甘肽含量，脂质过氧化，铁积累和线粒体形态是表征铁死亡的关键指标。脓毒症小鼠肝脏GSH含量明显降低，MDA和Fe²⁺水平明显升高，线粒体萎缩，双层密度增高。鸢尾素处理逆转了这些指标的水平，并在形态学上减轻了线粒体损伤(图3E-H)。这些结果表明，脓毒症小鼠肝脏铁死亡增多，而鸢尾素处理降低了脓毒症小鼠的铁死亡。除肝脏外，鸢尾素还能抑制CLP小鼠肺内铁死亡。 

Figure 3

4. 鸢尾素抑制CLP诱导的脓毒症小鼠的炎症反应

脓毒症时炎症因子的过度增加导致器官损伤。鸢尾素可以显著降低脓毒症小鼠血清IL-6和TNF- a的水平(图4A,B)。经鸢尾素处理后，脓毒症小鼠肝脏中IL-6、IL-1、CXCL1和CXCL10mRNA的表达显著降低(图4C)。同样，鸢尾素处理降低肾脏中IL-6和IL-1的水平，肺部IL-6、TNF-a和IL-1的水平，心脏中IL-6、TNF-a和CXCL1的表达。鸢尾素抑制了脓毒症小鼠的全身炎症。

Figure 4

5. 鸢尾素可减轻脓毒症小鼠线粒体损伤

如图5A，CLP手术导致线粒体肿胀，线粒体嵴消失，线粒体外膜破裂，内质网肿胀。在鸢尾素治疗组，这些改变明显减轻。为了探究鸢尾素是否对线粒体生物发生有影响，通过qPCR检测mtDNA拷贝数(mtDNA/nDNA)，在载体组中mtDNA拷贝数(mtDNA/nDNA)明显下降，而外源性鸢尾素处理增加了mtDNA拷贝数(图5B)。线粒体肿胀和线粒体外膜破裂提示线粒体功能受损。WB结果显示ATPB(与能量产生相关的蛋白质)和TFAM(线粒体生物发生相关蛋白)这两种蛋白在CLP中均显著下调，而在鸢尾素处理组中显著上调(图5C-E)。
Figure 5

6. 鸢尾素增加脓毒症小鼠和LPS刺激的L02细胞中线粒体活性和ATP的产生

肝线粒体活性用丝分裂追踪器红色评价，CLP诱导的脓毒症小鼠的红色荧光强度明显降低。外源鸢尾素处理明显增加了荧光强度(图6A,B)。肝脏ATP含量可以反映线粒体能量代谢。溶剂对照组中ATP含量显著降低，而鸢尾素处理后ATP含量显著增加(图6C)。L02细胞经脂多糖处理后，丝分裂追踪器红色的荧光强度和ATP含量显著降低，而鸢尾素处理可逆转这种影响(图6D,E)

Figure 6

7. 鸢尾素可以减轻脓毒症小鼠和LPS刺激的L02细胞中氧化应激水平

溶剂对照组中ROS显著增加，但鸢尾素处理显著降低了ROS的产生(图7A,B)。100 ng/mL鸢尾素处理可以逆转LPS刺激的LO2细胞中ROS水平 (图7C,D)。总之，鸢尾素治疗可调节脓毒症中的氧化应激。

Figure 7

8. GPX4抑制剂消除鸢尾素在脓毒症中的作用

在L02细胞中，观察铁死亡是否参与鸢尾素对脓毒症的保护作用。在L02细胞中观察到GPX4显著下调，而鸢尾素处理后GPX4蛋白水平显著升高(图8A,B)。RSL3是一种诱导铁死亡的GPX4特异性抑制剂，用于体外检测线粒体活性和ROS的产生。RSL3、LPS和鸢尾素处理24小时后，L02细胞红色荧光强度明显降低，ROS的产生显著增加(图8C)。与此同时，RSL3处理的L02细胞中GPX4、ATPB和TFAM蛋白表达明显下调(图8D-G)。GPX4的下调显示RSL3的强烈抑制作用，而ATPB和TFAM的下调则表明RSL3处理后线粒体功能受损。RSL3与鸢尾素处理导致脓毒症小鼠GPX4和TFAM蛋白水平明显降低(图9A,B)，而ROS生成明显升高(图9C,D)。 RSL3处理消除了鸢尾素对GSH、MDA和Fe²⁺的有益作用(图9E-G)。RSL3处理血清中ALT、AST、IL-6、TNF和肝脏中IL-6、IL-1、CXCL-1 mRNA表达明显升高(图9J)。以上结果表明，RSL3通过抑制GPX4破坏了鸢尾素对肝脏线粒体功能、ROS产生、肝脏损伤和全身炎症的保护作用。综上所述，铁死亡的增强消除了鸢尾素对脓毒症的保护作用。

Figure 8

Figure 9

9. 整合素抑制剂消除鸢尾素对GPX4和线粒体功能的影响

在骨细胞细胞系中，αV整合蛋白被鉴定为鸢尾素的受体，刺激信号转导。为了确定鸢尾素是否会影响铁死亡和肝线粒体，鸢尾素受体的抑制剂(精氨酸肽和Echistain)在LPS和鸢尾素存在的情况下处理L02细胞，对比鸢尾素组和RGD阴性对照组， GPX4蛋白表达、丝分裂追踪器荧光强度和ATP含量均显著降低(图10)。抑制鸢尾素的作用促进了鸢尾素和脂多糖处理的L02细胞的铁死亡和线粒体功能受损。

Figure 10