不要再昼夜颠倒了 可能会得结肠炎

   溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病统称为炎症性肠病(IBDs)，是一种全球性疾病，在发达国家发病率很高(0.3%)，在发展中国家发病率正在迅速升高，导致大量的医疗保健费用和工作生产力的损失。本文发现了由循环和NF-κB驱动的lncRNA（Lnc-UC）通过表观遗传修饰了生物钟基因Rev-erbα的转录，从而将生物钟与结肠炎联系起来。本文于2020年10月发表于《Science Advances》IF：13.116。

技术路线如下：

该文主要结果如下：

1、Lnc-UC是一个循环和大肠杆菌相关的lncRNA

结肠炎和正常小鼠RNA测序，筛选到197个差异表达的lncRNA，其中有28个是循环相关的，包括Lnc-UC (ENSMUST00000124503.1)（图1A-C）。Lnc-UC的表达具有明显的昼夜性，在ZT10时显著高表达，原位杂交(CISH)证实了小鼠结肠中存在Lnc-UC，且在其它组织中也存在表达，包括肺、心、脑、肾、腹膜巨噬细胞（PMs）等（图1D-F）。Lnc-UC主要分布于结肠细胞和骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的细胞核中（图1G-H）。

2、NF-κB驱动结肠炎小鼠表达Lnc-UC

KEGG揭示结肠炎与NF-κB通路及其相关通路的激活有关，如NF-κB靶向基因Ptgs2，IL-1β和Cxcl2的表达升高（图2A-B）。无论是BMDMs中还是血浆BMDMs 或者PMs中Lnc-UC的表达与LPS诱导的剂量和时间有依赖性（图C-F）。此外，重组Tnfα蛋白（NF-κB激活剂）和p65（NF-κB亚基）的过表达质粒都能诱导BMDMs中Lnc-UC的表达，而JSH-23（NF-κB抑制剂）则抑制Lnc-UC的表达（图2G-I）。双荧光素酶实验鉴定到两个Lnc-UC启动子与p65结合的区域，而重组Tnfα蛋白增强了p65募集至结合位点（图2）。总之，NF-κB驱动Lnc-UC的表达通过转录激活机制。

图2 NF-κB驱动结肠炎小鼠表达Lnc-UC

3、Lnc-UC在体外调节炎症

将Lnc-UC过表达和对照的BMDMs细胞用于RNA测序，发现Lnc-UC诱导免疫应答相关基因表达发生显著变化（图3A-B）。通过获得与缺失实验证实Lnc-UC是NF-κB靶向基因（包括Nlrp3, IL-6, Tnfα, IL-1β, and IL-18)）的负调节剂（图3C-D）。Lnc-UC敲除诱导的NF-κB靶向基因表达的改变可以通过Lnc-UC过表达恢复，表明Lnc-UC对NF-κB有特殊的作用（图3E）。与此一致，Lnc-UC抑制NF-κB的转录活性（图3F-G）。这表明Lnc-UC在NF-κB信号和炎症中扮演抑制作用。

图3 Lnc-UC作为炎症调节因子

4、Lnc-UC消融使小鼠对实验性结肠炎敏感

作者构建了Lnc-UC敲除小鼠（Lnc-UC^−/−），然后和WT鼠一起药物诱导发生实验性结肠炎，结果显示Lnc-UC^−/−小鼠对结肠炎的敏感性增加，体重丢失更大，疾病活性指标更高，结肠更短（图3H-K）。并且，Lnc-UC^−/−小鼠结肠炎病理更严重，此外，其预后与昼夜节律性显著相关（图3L-P）。总之，这些结果表明Lnc-UC调节小鼠昼夜性结肠炎。
          Lnc-UC调节生物钟基因Rev-erbα和炎症。Lnc-UC缺失导致生物钟基因表达中断，特别是Rev-erbα（图4A-B）。据报道Rev-erbα通过NF-κB信号通路和Nlrp3炎性小体参与生物钟和结肠炎的调节。因此探究其在Lnc-UC炎性机制中的作用。结果显示过表达Rev-erbα导致免疫响应相关基因表达改变，敲除Rev-erbα则导致炎性分子表达上调（图4C-D）。作者观察到，在BMDMs中，Lnc-UC和Rev-erbα相关的炎症富集通路高度重叠（图4E）。此外，Lnc-UC减少了Rev-erbα靶基因Nlrp3的表达，而这种抑制作用在Rev-erbα敲除小鼠中不存在（图4F）。由于RIP显示Lnc-UC和Rev-erbα不存在相互作用（图4G），所以作者进一步探究了其作用机制，结果发现过表达Lnc-UC导致细胞中Rev-erbα表达升高但是其靶基因Bmal1的表达减少，敲除则相反（图4H-I）。这些数据表明Lnc-UC获得的抗炎效果可能通过调节Rev-erbα的表达。

图4 Lnc-UC调节生物钟基因Rev-erbα和炎症

5、Lnc-UC通过与Cbx1相互作用，表观遗传调控Rev-erbα

Lnc-UC包括4个茎环结构可能用于靶向调控其它蛋白，实验表明Cbx1作为一个核蛋白可以与Lnc-UC相互作用（图5A-E）。结合位点位于1-74nt和326-432nt片段区域，一旦该区域突变，则不能调控Rev-erbα的表达和抑制炎症反应（图5F）。Lnc-UC敲除增强了H3K9的三甲基化，增加了对Rev-erbα的表观遗传调控的可能性（图5G）。ChIP实验显示Cbx1，Suv39h1和H3K9me3在Rev-erbα启动子区域显著富集，而Lnc-UC敲除增强了这种富集作用（图5H）。此外，Cbx1敲除则减少了H3K9me3在Rev-erbα启动子区域富集，促进了Rev-erbα的表达和转录（图5I-J）。总之，Lnc-UC通过减弱Cbx1介导的H3K9三甲基化来调控Rev-erb转录(图5K)。具体地说，Lnc-UC可能作为诱饵，吸引从Rev-erb启动子中去除Cbx1及其伙伴Suv39h1(图5K)。因此，H3K9的三甲基化减弱，Rev-erb转录被激活(图5K)。

图5 Lnc-UC与Cbx1和调节Rev-erbα转录通过减少H3K9的三甲基

6、hLnc-UC是一种循环、抗炎的lncRNA

探究Lnc-UC在小鼠中的功能能否由于高度的物种保守而存在于人类中，是很有意义的。因此，在人的样本中检测其是否存在，如图6A，人Lnc-UC（hLnc-UC）被扩增出来。并且hLnc-UC能在人结肠中检测到，结肠炎患者表现出hLnc-UC，NLRP3，IL-1β表达升高（图6B-C）。hLnc-UC在血清的THP-1细胞中有规律地表达，其模式类似于BMAL1（图6D）。 此外，hLnc-UC在THP-1细胞中的过表达导致Rev-erbα表达增加和Rev-erbα依赖性炎症因子水平降低（图6E-G）。在单核细胞衍生的巨噬细胞中也观察到了类似的结果（图6H-I）。 总之，这些数据表明，与结肠炎相关的hLnc-UC可能像在小鼠中一样促进Rev-erbα表达以抑制炎症。

图6 hLnc-UC是一种循环、抗炎的lncRNA

NF-κB驱动的Lnc-UC充当Rev-erbα的表观遗传调控因子，从而协调了昼夜节律和结肠炎。 Lnc-UC可能在干预炎症和昼夜节律之间的交流并控制结肠炎。

参考文献：

Wang Shuai., Lin Yanke., Li Feng., Qin Zifei., Zhou Ziyue., Gao Lu., Yang Zemin., Wang Zhigang., Wu Baojian.(2020). An NF-κB-driven lncRNA orchestrates colitis and circadian clock. Sci Adv, 6(42), undefined. doi:10.1126/sciadv.abb5202