KRAS介导自噬依赖性铁死亡驱动肿瘤相关巨噬细胞的极化

研究背景：

KRAS是人体肿瘤中最常见的突变癌基因。尽管很多研究报道了KRAS突变对癌细胞的影响，但是致癌KRAS的激活对免疫细胞的直接影响仍不清楚。文章研究细胞外KRAS^G12D作为癌细胞-巨噬细胞间通信的关键中介（IF= 9.77）。

技术路线图：

研究结果：

1. 在自噬依赖性铁下垂癌细胞死亡中，KRAS^G12D在胞外释放

胰腺导管腺癌（PDAC）的发生和发展与氧化应激有关。在人PDAC细胞系（PANC1和AsPC1，都发生KRAS^G12D突变）确定氧化应激是否会诱导癌蛋白的释放。H₂O₂以时间依赖性的方式诱导NC1和AsPC1细胞以及人初级PDAC细胞(pHsPDAC)释放KRAS^G12D (图1A)。提示氧化应激引起PDAC细胞释放KRAS^G12D。H₂O₂可以触发多种形式的调控细胞死亡，比如细胞凋亡，坏死和自噬依赖的细胞死亡。H₂O₂诱导的细胞死亡(图1B)和PDAC细胞释放KRAS^G12D(图1C)被自噬抑制剂阻断（chloroquine），但是凋亡抑制剂或坏死凋亡抑制剂（Z-VAD-FMK和necrosulfonamide）没有这种作用。敲除自噬相关基因限制了H₂O₂诱导的细胞死亡和KRAS^G12D的释放（图1E-1G），进一步证实自噬依赖性细胞死亡促进氧化应激期间KRAS^G12D蛋白释放。

铁死亡抑制剂(ferrostatin-1和baicalein)阻断H₂O₂诱导的MAP1LC3B的斑点形成(图1H)，抑制PDAC细胞死亡(图1B)和KRAS^G12D释放(图1C)。Erastin和RSL3等铁死亡诱导剂也能诱导MAP1LC3B斑点(图1I)、MAP1LC3B脂化(产生MAP1LC3B II)和KRAS^G12D释放(图1K)。敲除ATG5逆转这些效应(图1I - 1k)。结果提示铁死亡可导致PDAC细胞中KRAS^G12D蛋白的释放。

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2. 巨噬细胞外泌体摄取KRAS^SG12D需要AGER

之后研究了KRAS^G12D蛋白是否存在于外泌体中。电子显微镜、纳米颗粒分析和WB检测外泌体分离方法的纯度。囊泡大小50-150nm (图2A、2B)，WB检测CD63、CD81、PDCD6IP/ALIX、TSG101、HSP90B1 / GRP94和CYCS (图2C)进一步证明。在PANC1和AsPC1细胞分离的外泌体中，H₂O₂刺激导致KRAS^G12D蛋白(不影响CD63和PDCD6IP/ALIX)的增加；氯喹和ferrostatin-1阻断了KRAS^G12D蛋白的积累(图2D)；敲除自噬相关基因ATG5或应用GW4869（外泌体生成和释放的抑制剂）抑制了H₂O₂诱导的KRAS^G12D蛋白的积累(图2E，F)。外泌体分泌的关键调节因子RAB27A的敲除也抑制了H₂O₂诱导的PANC1细胞释放KRAS^G12D (图2G)。KRAS^G12D和PDCD6IP/ALIX均对蛋白酶K不敏感，但被Triton X-100降解(图2I)。这些发现表明自噬依赖的铁死亡导致KRAS^G12D从外泌体释放。

之后研究肿瘤来源外泌体中的KRAS^G12D蛋白是否能被巨噬细胞吸收。人外周血单核细胞来源巨噬细胞(PBMCMs)通常不含KRAS^G12D，但以时间依赖性的方式吸收H₂O₂产生的癌症外泌体(图2J)，提示肿瘤KRAS^G12D可进入巨噬细胞。AGER抗体抑制H₂O₂生成的癌症外泌体培养的PBMCMs对KRAS^G12D的摄取(图2K)。类似地，在PBMCMs中，敲除AGER损害了KRAS^G12D从肿瘤来源外泌体的摄取(图2L)。结果表明，AGER介导巨噬细胞摄取KRAS^G12D

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3. KRAS^G12D通过STAT3依赖性脂肪酸氧化促进巨噬细胞M2极化

巨噬细胞摄取KRAS^G12D可能影响巨噬细胞极化。敲除PBMCMs中KRAS^G12D，并检测M1分化(IL-12A、TNF和NOS2/iNOS)或M2极化(IL-10、ARG1和TGFB1)的生物标志物。

表达KRAS^G12D的PBMCMs中IL-10、ARG1和TGFB1 mRNA（M2极化）表达上调(M1极化不变)；H₂O₂产生的癌症外泌体也增加了PBMCMs产生的M2 mRNA表达， AGER敲除所逆转(图3A)。因此，KRAS^G12D的摄取可能导致促癌的M2极化。脂肪酸氧化的情况类似(图3B)。脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir降低了KRAS^G12D表达或PDAC细胞来源的外泌体的PBMCMs中IL10、ARG1和TGFB1 mRNA表达(图3A)。因此，脂肪酸氧化有助于KRAS^G12D介导的M2巨噬细胞极化。

为了解KRAS^G12D驱动的巨噬细胞中脂肪酸氧化加剧的机制，文章重点研究了STAT3。 WB分析发现在表达KRAS^G12D或肿瘤外泌体处理的PBMCMs中，STAT3的磷酸化水平上调(图3C)。与AGER的敲除类似，在KRAS^G12D或H₂O₂诱导的癌症外泌体的PBMCMs中，敲除STAT3减少脂肪酸氧化(图3B)和M2巨噬细胞极化(图3A)。因此，AGER介导的STAT3的活化需要KRAS^G12D-诱导脂肪酸氧化和巨噬细胞极化。

之后，确定参与脂肪酸氧化代谢途径的基因是否会被AGER介导的STAT3激活所调控。在表达KRAS^G12D的PBMCMs中，其他脂肪酸氧化相关基因(如CPT1B, CPT1C, CPT2, ACADL, ACADSB, ACAD9, ACAD10, ACAD11,ACADS,ACADVL,和ACAA2)上调 (图3 D)。这一效应被敲除AGER或STAT3抑制(图3D)。在KRAS^G12D表达或对癌症外泌体应答的PBMCMs中，敲除CPT1A和ACADM抑制脂肪酸氧化(图3B)和IL10、ARG1和TGFB1 mRNA表达(图3A)。结果表明AGER-STAT3通路对于KRAS^G12D诱导的脂肪酸氧化和随后的巨噬细胞M2极化至关重要。

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4. 体内阻断KRAS^G12D的释放和摄取抑制巨噬细胞介导的胰腺肿瘤生长

探索KRAS^G12D蛋白从癌细胞向巨噬细胞的可能路径。在NOD SCID小鼠背侧皮下注射PANC1细胞或PANC1细胞+PBMCMs。与单用PANC1细胞相比，PBMCMs促进了胰腺肿瘤的生长(图4A)。局部注射氯喹、ferrostatin-1或抗AGER抗体可抑制PANC1+PBMCMs引起的肿瘤的生长 (图4)。AGER的敲除(图4B)降低了由PANC1细胞+PBMCMs引起的肿瘤生长。此外，KRAS^G12D驱动的PBMCMs比野生型PBMCMs更能促进胰腺肿瘤的生长(图4C)。当STAT3、ATG5、CPT1A或RAB27A敲除时，PBMCMs表达KRAS^G12D的肿瘤加速作用消失(图4C)。这些发现表明，KRAS^G12D或KRAS^G12D转入PBMCMs可通过ATG5、STAT3、CPT1A和RAB27A等通路驱动PDAC的进展。

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5. 巨噬细胞中KRAS^G12D的高表达与PDAC患者较差的生存相关

为了确定在人类胰腺癌中KRAS^G12D在巨噬细胞表达异常，分析59个PDAC病人(表1)。在CD68⁺巨噬细胞中检测出KRAS^G12D表达(图5A)。PDAC病人CD68⁺巨噬细胞中有高KRAS^G12D显示短生存期，比病人含有低KRAS^G12D在肿瘤浸润性CD68 +巨噬细胞 (图5B)。这些发现表明巨噬细胞摄取KRAS^G12D的增加可能促进了人PDAC的进展。

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