顺铂和溶瘤病毒调节囊泡转运，激活抗肿瘤免疫
研究背景：铂耐药限制了其在恶性肿瘤中的临床应用。研究发现铂耐药是由于细胞药物外排增加，DNA修复的激活和治疗后生存途径的诱导。已有研究报道CP和oHSV联用在肺癌和膀胱癌中的研究，并且溶瘤性牛痘和腺病毒对卵巢癌有治疗效果，美国德克萨斯大学洪邦星等人在临床癌症研究这一杂志上发表文章，研究了oHSV感染后癌细胞顺铂外排情况和抗肿瘤免疫。
技术路线图：
研究结果：
1.溶瘤性HSV (oHSV)感染增加顺铂耐药的卵巢癌细胞中顺铂的保留
感染RAMBO之后卵巢癌细胞中CP含量显著增加(图1B和 C)，荧光共聚焦显微镜显示， RAMBO感染细胞内观察到的CP在细胞质和细胞器中。文章通过RNA测序分析了RAMBO感染细胞和未感染细胞之间基因表达变化分析CP保留增加的分子机制。差异表达(DE)基因的GO和KEGG通路分析显示，细胞外泌体相关通路中的基因存在显著的全局失调(图1D)。热图分析显示，在感染RAMBO的细胞中，几乎所有与细胞外泌体相关的基因均显著下调(图1E)。溶酶体途径中基因表达变化的热图结果类似 (图1F)。共聚焦荧光显微镜显示CP与溶酶体标记LAMP-1共定位(图1G)。这些结果说明RAMBO病毒感染导致囊泡运输的改变，导致CP保留增加。
ATP11B和ATP7B这两种囊泡膜蛋白与CP外排有关。感染后两种OC细胞的ATP11B和ATP7B蛋白表达均显著降低。单独或联合沉默这两个基因可导致CP保留增加(图1I)。当这两个基因过表达时，OC细胞的CP保留显著减少(图1J)。通过外泌体/溶酶体途径对CP的外排会受到OV感染的影响。
Figure 1
2. oHSV和CP增加DNA损伤和STING介导的免疫
在两种不同的OC细胞系TR127和TR182中，用RAMBO处理的细胞中，cp特异性DNA加合物显著增加(图2A)。，联合使用RAMBO和CP的OC细胞系中p-H2AX和p-CHK2蛋白（当DNA损伤）均有所增加(图2B)。荧光显微镜分析显示CP和RAMBO联合处理的细胞中微核的存在有所增加(图2C)。对四个组（细胞进行基因表达分析，发现控制病毒防御反应、炎症反应和I型干扰素信号通路的基因本体论(GO)途径显著增加(图2D)。基因集富集分析(GSEA)也显示，CP和RAMBO联合处理的细胞中STING-IFN通路显著富集(图2E)。通过cGAMP分泌和IFN基因表达，我们发现与单独治疗的细胞相比，联合使用RAMBO和CP治疗的细胞cGAS/STING通路被显著激活(图2F和G)。
Figure2
3. RAMBO和CP共处理OC细胞激活天然抗肿瘤免疫
用CP和/或RAMBO处理原代人OC细胞，结果显示两种实际连用导致肿瘤细胞死亡增加 (图3 A和B)。当联合处理的细胞叠加到人源PBMCs, OC细胞对PBMC介导的肿瘤杀伤的敏感性显著增加(图3A和B)。此外，联合培养肿瘤细胞的PBMCs释放的IFN也显著增加，说明PBMC活化增强(图3C)。STING的激活也可以诱导肿瘤细胞上的NKG2D配体。联合处理的OVTOKO细胞NKG2D配体表达显著增加(图3D)。用RAMBO和CP处理的OVTOKO细胞与人供者来源的NK细胞共培养，流式细胞术发现CD56+ NK细胞上NKG2D表达明显增加，IFN分泌明显增加 (图3E和F)。
Figure 3
4. CP和RAMBO联合对人源性顺铂耐药OC的体内抗肿瘤效果
NSG小鼠腹腔内植入表达荧光素酶和GFP的TR182细胞(TR182- luci -GFP) (图4A) IVIS活体成像显示，联合使用RAMBO和CP的小鼠肿瘤负荷显著降低(图4B和C)。联合治疗显示肿瘤结节的数量和肿瘤重量显著减少(图4D和E)。流式细胞术分析GFP +肿瘤细胞显示剩余肿瘤结节中肿瘤细胞的百分比显著下降(图4F)。通过H& E和Ki67染色对肿瘤切片进行免疫组化分析，发现联合用药的小鼠肿瘤细胞增殖减少(图4G)。流式细胞仪对肿瘤结节的免疫表型显示，联合治疗小鼠的CD206+ M2巨噬细胞的百分比显著减少，而CD86+ M1巨噬细胞显著增加(图4H)。这些结果表明联合治疗小鼠的免疫抑制整体降低。与CP治疗的小鼠相比，RAMBO治疗显著增加了肿瘤中的铂保留。使用RAMBO和CP的小鼠肿瘤结节显示cGAMP水平明显高于一种试剂单独处理(图4J)。
Figure 4
在C57BL/6小鼠腹腔内植入ID8 -荧光素酶(ID8-Luc)细胞，处理时间点如图 5A。IVIS成像显示使用RAMBO和CP治疗的小鼠的肿瘤生长显著减少(图5B C)，小鼠的腹部腹水明显减少(图5D)。对小鼠的脾细胞进行分析(RAMBO后3天)，联合治疗小鼠的CD4、CD8 T细胞(图5e)和NK细胞(图5f)释放的IFN细胞均有所增加。CD86+CD11c+和MHCII+CD11c+树突状细胞(DCs)在联合治疗小鼠中的比例也有所增加(图5G)。
为了检验联合治疗对体外DC活化的影响， OVTOKO与RAMBO、CP或两者在改良的小室中与人pbmc来源的DC细胞共培养。联合治疗的OVTOKO细胞共培养的树突细胞的细胞质DNA和线粒体DNA含量显著增加(图5H)。联合治疗后两种OC和DC细胞中cGAS基因表达显著增加(图5I左图OC, 图5I右图DC)。DC与联合处理的OCs共培养诱导产生大量IFN干扰素，当树突状细胞敲除STING时，功能被抑制（(图5J）。结果表明STING信号在CP和RAMBO联合处理的OC细胞的DC反应中起重要作用。
评估DC活化对T细胞活化的影响，将经过RAMBO和/或CP处理的OVTOKO细胞与DCs和CD3+ T细胞共培养96小时。当这些细胞与联合治疗的OC细胞共培养时，细胞的CD44+CD4+和CD44+CD8+均显著升高(图5K)。当T细胞和树突状细胞与用CP和RAMBO处理的OC细胞共培养时，IFN的分泌显著增加 (图5L)。CP和RAMBO处理的小鼠T细胞表面PD1的表达与单独RAMBO处理相比没有显著变化(图5)。
Figure 5
