被逼无奈的帮凶：M2巨噬细胞促进食管癌进展

FOXO1对于调节细胞因子和趋化因子非常关键，但是它在肿瘤微环境中的功能一直未能明确。在这篇文章中，作者表征了FOXO1的预后价值，以及肿瘤来源的FOXO1和M2巨噬细胞在ESCC中的相互作用。本文于2020年9月16发表在《Theranostics》IF：8.579。

技术路线：

主要实验结果如下：

1、过表达FOXO1预示ESCC的不良预后和高M2巨噬细胞浸润

52对ESCC病人样本中检测FOXO1的表达，结果显示肿瘤组织中显著高于对照，随后在144例样本中验证了该结果。生存曲线表明FOXO1高表达与患者不良预后相关（图1A-C）。

随后使用RNA测序从三株ESCC肿瘤中鉴定到22种免疫细胞浸润，其中CD4记忆检测T细胞，M2巨噬细胞，和单核细胞在ESCC中的浸润水平最高（图1D）。但是TCGA和实验数据分析显示，免疫细胞中只有M2巨噬细胞标志物CD206在FOXO1高表达组显著上调，随后组织（图1E-F）。肿瘤组织的病理评估揭示更多的巨噬细胞，尤其是CD206阳性的巨噬细胞，会在肿瘤高表达FOXO1的肿瘤间质边缘浸润（图1G-H）。

图1在ESCC病人中，过表达FOXO1与较差的生存结果和高M2巨噬细胞浸润相关

 2、FOXO1促进M2巨噬细胞浸润异种肿瘤

作者将FOXO1(+)和FOXO1(-)肿瘤细胞注射于裸鼠两侧，3周后取肿瘤进行检测。结果显示FOXO1(+)组的M2巨噬细胞浸润水平显著高于FOXO1(-)组。此外，CD68在FOXO1(+)肿瘤组织中过表达，提示肿瘤来源的FOXO1在体内可促进巨噬细胞浸润。FOXO1(+)肿瘤组织中浸润的巨噬细胞主要为CD206阳性。

图2 M2巨噬细胞浸润小鼠模型

 3、FOXO1调节CCL20的表达

此前的研究表明，TNF-α刺激FOXO1过表达会显著放大NF-κB依赖的CCL20的产生。此外，CCR6是CCL20的受体，在多种髓细胞系表达，包括巨噬细胞。所以进一步研究FOXO1是否影响CCL20的表达，结果显示在FOXO1(+)的肿瘤细胞中CCL20上调表达，干扰FOXO1则CCL20的表达下调（图3A-D）。

4、FOXO1(+)的肿瘤细胞通过CCL20分泌促进M2巨噬细胞募集

作者发现当与FOXO1(+)的肿瘤细胞孵育后M2巨噬细胞的迁移显著增加了（图3E）。随后用CCL20的重组蛋白处理M2巨噬细胞发现其迁移也显著增加，但是使用CCL20的抗体预处理后则M2巨噬细胞的迁移降低了。与此一致，干扰FOXO1(+)的后M2巨噬细胞的迁移也显著下降（图3E-G）。这些结果表明FOXO1是通过分泌CCL20介导M2巨噬细胞迁移。

图3 FOXO1(+)肿瘤细胞通过分泌CCL20促进M2巨噬细胞募集

 5、FOXO1(+)肿瘤细胞促进M0巨噬细胞向M2巨噬细胞极化

作者构建了ESCC肿瘤细胞与M0巨噬细胞的共培养系统，流式检测结果显示当两者共培养时M2巨噬细胞的组分（CD163+/CD68+）显著增加了（图4A）。相反，敲除FOXO1则M2极化显示受损（图4B）。为了全面评估诱导M2巨噬细胞极化表型，分析了其标志物的表达。结果发现FOXO1诱导的M2巨噬细胞显著高表达CD206, CD163, IL10, CCL18, CLEC7A,和STAT6（图4C）。而GSEA结果显示FOXO1诱导的M0巨噬细胞具有与IL-4刺激的M2巨噬细胞类似的分子特征（图4D-E）。表明FOXO1诱导的巨噬细胞都是M2巨噬细胞。

6、CSF-1介导FOXO1诱导的M0巨噬细胞极化

CCL20是作者发现的FOXO1诱导M0巨噬细胞向M2极化的第一个细胞因子，但是作者发现CCL20并不能显著影响M2巨噬细胞标志物的表达。于是作者依据前人的研究猜测CSF-1可能也在M2巨噬细胞分化中扮演了重要作用。结果表明CSF-1在FOXO1(+)肿瘤细胞中显著上调（图4F-H）。随后还发现，沉默FOXO1后CSF-1的过表达显著减少了，并且FOXO1抗体显著参与了CSF-1启动子的片段的富集（图4FI-J）。随后，将FOXO1(+)肿瘤细胞与M0巨噬细胞在CSF-1抗体存在的情况下进行共培养，结果发现，CD163+/CD68+的比例显著下降，而CSF-1刺激后CD206，CD163和CCL18的表达显著上调，CD163+/CD68+的比例也显著升高（图4K-L）。

图4 FOXO1(+)肿瘤细胞通过产生CSF-1促进M0巨噬细胞向M2巨噬细胞极化

 7、FOXO1通过M2巨噬细胞介导FAK/PI3K/AKT信号促进肿瘤细胞增殖和迁移

M2巨噬细胞分泌肿瘤促进因子，包括Arg-1，TGF-b和CCL18，这些都与肿瘤进展相关。为了探究M2巨噬细胞对肿瘤的促进作用，作者将M2的条件培养基与ESCC肿瘤细胞共培养，结果显示其显著促进ESCC细胞的增殖和集落形成（图5A-B）。进一步在体内验证其促肿瘤作用，结果发现与对照相比，M2条件培养基处理过的ESCC细胞的成瘤更大（图5D）。接着作者探究了M2促进肿瘤生长的通路。结果显示，M2调节培养基处理过后，增强了FAK，PI3K和 AKT的磷酸化（图5E）。为了验证M2介导的激活，使用PI3K抑制剂LY294002阻断结果发现AKT的激活被显著抑制（图5F）。LY294002处理后经M2条件培养基诱导的集落形成，细胞活力和增殖都显著减少了（图5G）。这些结果表明M2巨噬细胞激活了FAK/PI3K/AKT通路促进肿瘤增殖。

据报道CCL18参与了多种癌症的FAK/PI3K/AKT通路和上皮间质转化，因此，收集M0，M2和FOXO1(+)/(-)诱导的M0巨噬细胞以检测CCL18的浓度。结果显示，M2巨噬细胞中CCL18的表达显著上调（图J）。此外，CCL18重组蛋白能激活FAK/PI3K/AKT通路（图K）。总之，尽管M2巨噬细胞和肿瘤细胞间的相互影响较为复杂，但是这些结果表明由M2巨噬细胞分泌的CCL18是其相互关联的因子之一。

图5 M2巨噬细胞通过FAK/PI3K/AKT信号通路促进肿瘤细胞增殖和迁移

参考文献：

Wang Ying., Lyu Zhaojie., Qin Yanru., Wang Xia., Sun Liangzhan., Zhang Yu., Gong Lanqi., Wu Shayi., Han Shuo., Tang Ying., Jia Yongxu., Kwong Dora Lai-Wan., Kam NgarWoon., Guan Xin-Yuan.(2020). FOXO1 promotes tumor progression by increased M2 macrophage infiltration in esophageal squamous cell carcinoma. Theranostics, 10(25), 11535-11548. doi:10.7150/thno.45261