具核梭杆菌感染的结直肠癌细胞的外泌体与结直肠癌进展
瘤细胞释放的外泌体充满了独特的RNA和蛋白质，它们正在成为促进肿瘤进展的通讯网络中重要的介体。具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum, Fn)是结直肠癌(CRC)相关的重要细菌。到目前为止，Fn感染的CRC细胞外泌体的功能尚未被探索。今天小编给大家介绍一篇发表于影响因子为19.819的“gut”杂志上的文章“Exosomes derived from Fusobacterium nucleatum-infected colorectal cancer cells facilitate tumour metastasis by selectively carrying miR-1246/92b-3p/27a- 3p and CXCL16”，为大家介绍Fn感染的CRC细胞外泌体在结直肠癌中的作用。
在本文中，我们证明外泌体可以将miR-1246/92b- 3p/27a- 3p和CXCL16/RhoA/IL-8从Fn感染的细胞传递到未感染的细胞，从而增加体外细胞迁移能力，促进体内肿瘤转移。循环外泌体miR-1246/92b-3p/27a-3p和CXCL16水平与结直肠癌患者的Fn丰度和肿瘤分期密切相关。
结果：
1）Fn感染可增加CRC细胞外泌体的分泌
为了研究CRC细胞特异性Fn感染的相关外泌体，HCT116细胞被活Fn感染后培养48h。然后，从Fn-感染的HCT116细胞的上清液中分离外泌体(Fn- Ex)，以未感染的HCT116细胞(Ex)和大肠杆菌感染HCT116细胞(Ec-Ex)的外泌体作为对照。透射电镜分析显示，纯化后的囊泡样品呈椭圆形和球形(图1A)。NTA结果显示，Fn-Ex的粒径和数目略大于Ex(图1B)。此外，通过Fn-Ex、Ex和Ec-Ex的Western blotting验证了外泌体生物标志物(CD9和CD63)的存在(图1C)。Fn感染显著增加了同样体积培养上清液中收集的外泌体分泌量(图1D)。共聚焦成像显示Fn-Ex在孵育6小时后确实被HCT16细胞吸收(图1E，F)。这些数据表明Fn感染能增加CRC细胞外泌体的分泌量，受感染细胞能分泌略大的外泌体。
2）Fn感染细胞的外泌体促进CRC细胞的迁移
为了测定Fn-感染细胞释放的外泌体对受体细胞的影响，我们分别用HCT116和SW480细胞孵育Fn-Ex、Ex和Ec-Ex。CCK8实验显示，Ec-Ex处理后，HCT116和SW480细胞表现出显著毒性，Fn-Ex或Ex处理后，细胞表现出轻微但不显著毒性(图2A)。有趣的是，Fn-Ex处理的HCT116和SW480细胞形态发生明显变化，形成纺锤形，这与Ex处理或Ec-Ex处理的细胞不同(图2B)。此外，Transwell迁移实验显示，Fn-Ex处理显著促进HCT116细胞迁移到Ex和Ec- Ex处理未观察到的水平。SW480细胞为受体细胞时，也观察到类似的趋势(图2C)。此外，划痕实验进一步表明，Fn-Ex处理能显著加速HCT116和SW480细胞创面愈合(图2D)。这些结果表明，来自Fn感染细胞的外泌体改变了细胞形态，促进了CRC细胞的迁移，提示Fn感染细胞的外泌体可能对受体细胞进行了重构。
3）特异性miRNA在Fn感染的CRC细胞分泌的外泌体中富集
接下来，通过miRNA-seq分析Fn-Ex和Ex的差异microRNA表达谱。从Fn-Ex和Ex中分离得到的总RNA中miRNA的百分比分别为16.55%和13.26%(图3A)。两组同时鉴定了282个miRNAs。两组间重叠和独特的miRNAs数量如图3B所示。接下来比较Fn-Ex和Ex中miRNA的表达水平，发现两组间有91个miRNA有显著差异(图3C)。与Ex比较，Fn-Ex有23个miRNA上调，1个miRNA下调(图3D)。此外，通过RT- qPCR对Fn-Ex、Ex、Ec-Ex和K-Fn-Ex(来自Fn灭活的HCT116细胞的外泌体)中表达最高的前10个miRNA进行验证。5种miRNA (miR-27a-3p、miR-21-5 p、miR-7704、miR-92b-3p和miR-1246)在Fn-Ex中显著升高。与Ex、Ec-Ex和K-Fn-Ex相比，Fn感染显著增加了三种miRNAs(miR-1246, miR- 92b- 3p和miR- 27a- 3p)的表达水平(图3E)。这些数据表明，活Fn感染改变了CRC细胞外泌体miRNA谱，并伴随miR-1246/92b- 3p/27a- 3p的表达增加。
4）外泌体miR-1246/92b-3p/27a-3p通过靶向GSK3β，激活Wnt/βcatenin通路，促进CRC细胞迁移
为了探究Fn感染过程中外泌体miRNAs的潜在生物学功能，我们选择了miR-1246/92b-3p/27a-3p产生过表达(mimics)和敲除(抑制剂)miRNAs。Transwell迁移实验显示，与阴性对照(NC)相比，miR-1246/92b-3p/27a-3p模拟物显著促进HCT116细胞的迁移，而三种miRNA抑制剂联合作用可部分消除Fn-Ex介导的迁移。在SW480细胞中也观察到类似的趋势(图4A)。此外，划痕实验显示，与对照HCT116细胞和SW480细胞相比，miR-1246/92b-3p/27a-3p模拟物明显促进伤口闭合，而三种抑制剂联合使用在一定程度上挽救了Fn-Ex介导的伤口闭合率(图4B)。
接下来，基于生物信息学分析的预测结果，我们发现miR-1246/92b- 3p/27a- 3p可以直接靶向GSK3βmRNA的3’-UTR，并且这种关联在物种间高度保守。我们进一步生成荧光素酶报告质粒，该质粒在GSK3β的3’-UTR内含有野生型(WT)或突变型miR-1246/92b- 3p/27a-3p结合位点(图5A-C)。如图5D-F所示，miR-1246/92b-3p/27a-3p模拟物和Fn- Ex或抑制剂显著抑制或增加了含有GSK3βWT 3’-UTR的报告基因的荧光素酶活性，但在突变细胞株中未观察到抑制作用。此外，我们发现GSK3β在过表达的miR-1246/92b- 3p/27a- 3p细胞中持续下调，而在miR-1246/92b-3p/27a-3p抑制细胞中上调，这表明GSK3β可能是miR-1246/92b- 3p/27a- 3p的靶基因(图5G)。
然后，通过Western blot检测GSK3β和Wnt/β-catenin通路的表达。如图6所示，与Ex处理相比，Fn-Ex处理的HCT116和SW480细胞中GSK3β水平显著降低，而Fn-Ex处理的两种细胞中β-catenin水平均升高。Fn-Ex处理后上皮标记物E-cadherin表达降低，间质标记物波形蛋白表达升高。Fn- Ex处理后原癌基因Cyclin D1和C- Myc表达增加。在三种miR-1246/92b- 3p/27a- 3p模拟物中也观察到类似的结果。总之，这些结果表明，在Fn感染过程中，富含miR-1246/92b- 3p/27a- 3p的外泌体通过靶向GSK3β并激活Wnt/β-catenin通路诱导CRC细胞迁移。
5）Fn感染的CRC细胞外泌体蛋白的鉴定和功能分类
为了筛选Fn-Ex携带的特异性蛋白，用蛋白质组学方法研究Fn-Ex和Ex的差异蛋白表达谱。Venn图分析显示两组间有197个蛋白重叠。Fn- Ex携带187个特异蛋白，其中85个Fn蛋白和102个细胞蛋白(图7A)。KEGG通路分析显示，核糖体、趋化因子信号通路和mTOR信号通路在这些蛋白中富集(图7B)。众所周知，趋化因子信号通路参与肿瘤转移。我们进一步选择了三种具有趋化因子信号通路的蛋白，通过免疫印迹法进行验证。如图7 C，与Ex相比，IL-8、CXCL1和RhoA在Fn-Ex中富集更多。有趣的是，与Ex相比，CXCL16在Fn-Ex中表现出最强的丰度。此外，WB显示，CXCL16在Fn感染的HCT116细胞中增加(图7 D)。Transwell迁移试验显示Fn-Ex促进迁移，抗CXCR6抗体治疗很大程度上废除了Fn-Ex介导的迁移(图7E)。在伤口愈合划痕试验中，用抗CXCR6抗体治疗也阻断了迁移(图7F)。这些数据表明，Fn感染可增加CRC细胞中转移相关蛋白CXCL16的表达，CXCL16进一步被Fn-Ex选择性包装富集，通过CXCL16/ CXCR6轴促进肿瘤细胞迁移。
6）Fn感染细胞分泌的外泌体促进结直肠癌转移
为了评价Fn感染外泌体对体内肿瘤转移的潜在作用，我们在两种小鼠结直肠肿瘤模型中评价了Fn-Ex的活性。HCT116细胞皮下注射(BALB/c裸小鼠)建立CRC移植瘤模型。给予Ex、Fn-Ex或si-Ex直到肿瘤体积达到50 mm3(图8A)。21天后，手术切除肿瘤(图8B)。H&E肝切片显示，Fn-Ex组肝内血管周围有明显的肝内转移，而其他三组几乎没有转移迹象(图8C，D)。此外，通过免疫组化和Western blotting分析，Fn-Ex处理组肿瘤组织中GSK3β的表达降低，而si-Ex显著逆转GSK3β的表达(图8E，F)。我们还研究了Fn-Ex是否能增强CT26同种肺移植的小鼠的肿瘤转移。静脉给予Ex、Fn-Ex、si-Ex或PBS对照(图8G)。与其他三组相比，Fn-Ex治疗组肺表面结节数最高(图8H，I)。H&E肺切片显示Fn-Ex组损伤肺组织内癌巢面积最大、数量最多(图8J)。此外，Fn- Ex给药组肺组织中GSK3β表达降低(图8K，L)。这些结果表明，来自Fn感染细胞的外泌体通过携带Fn感染特异性miRNA和蛋白在体内显著促进肿瘤转移。
7）miR-1246/92b-3p/27a-3p和CXCL16与结直肠癌患者临床特征的关系
我们从结直肠癌患者和HS患者的血清中分离并鉴定外泌体。Western blots显示，这些外泌体高度富集外泌体相关蛋白CD63和CD9(图9A)。进一步从循环外泌体中提取RNA。我们比较了每个患者的样本之间miR-1246/92b- 3p/27a- 3p平均值。CRC患者循环外泌体miR-1246/92b-3p/27a-3p水平明显高于HS患者(图9B)。此外，用qPCR检测了82例粪便样品中Fn的携带情况。采用Pearson相关系数和线性回归分析Fn水平与循环外泌体miR-1246/92b-3p/27a-3p之间的相关性。Fn丰度与miR-1246和miR- 27a- 3p水平呈正相关，而与miR- 92b- 3p无相关性(图9C)。此外，与HS相比，CRC患者循环外泌体CXCL16水平显著上调(图9D)。更重要的是，循环外泌体CXCL16与CRC患者Fn丰度呈正相关(图9E)。这些结果表明循环外泌体miR-1246、miR- 27a- 3p和CXCL16水平在CRC患者中升高，并与肠道Fn丰度呈正相关，提示Fn水平过高可能通过释放Fn相关外泌体促进肿瘤进展。
结论：Fn感染可能刺激肿瘤细胞产生富含miR-1246/92b-3p/27a-3p和CXCL16/RhoA/IL-8外泌体，这些外泌体并传递到未感染细胞以促进转移前行为。