TCGA数据库和单细胞测序数据库揭示胶质瘤免疫浸润 和免疫基因对患者生存的影响

胶质母细胞瘤（GBM）是最常见的原发性恶性脑肿瘤，约占所有原发性恶性脑肿瘤的80%，且预后不佳，生活质量差，中位生存期< 1年。GBM的标准治疗是手术切除，伴随放疗和替莫唑胺化疗。虽然由于基因治疗、免疫治疗、疫苗治疗等的发展，多种治疗方法有所改善，管理GBM复发的治疗选择依然有限。大多数基于免疫检查抑制点的GBM临床研究和疫苗疗法的试验都没有成功。通过免疫治疗GBM临床试验失败的原因归因于几个因素，包括高度免疫抑制环境和多种治疗耐药机制。GBM诱导局部免疫功能障碍和全身免疫抑制，从而引起GBM与周围肿瘤微环境之间更复杂的偶联关系。肿瘤微环境是局部免疫功能紊乱的至关重要的因素之一，它为癌细胞、多种基质细胞和细胞外成分建立了小生境。肿瘤微环境在特定条件的建立中起着关键性作用，从而干扰血管生成、细胞死亡、氧化应激和免疫逃逸。越来越多的研究揭示，肿瘤微环境不仅在肿瘤的发生、进展和迁移中至关重要，而且还影响治疗耐药性和恶性肿瘤的产生。肿瘤微环境的细胞组成和免疫细胞的可及性在GBM亚型和患者中表现出较大的变异。这些因素导致GBM的免疫抑制，进而导致免疫治疗失败。鉴定与肿瘤微环境相关的积极参与类型的免疫基因和免疫细胞有助于阐明GBM免疫抑制的一般机制。近期，浙江大学医学院附属第一医院神经外科潘剑威教授及其团队调查了GBM中生存相关的免疫细胞，并确定了与免疫细胞浸润相关的hub基因，相关研究以“Identification of Immune Cell Infiltration and Immune-Related Genes in the Tumor Microenvironment of Glioblastomas”为题发表在Front Immunol杂志上，杂志影响因子为5.085。 

技术路线：

结果：

1、生存相关免疫细胞的来源和鉴定

作者从TCGA数据库下载166例GBM的公开数据，包括RNA-Seq和临床数据，使用Kaplan-Meier生存分析免疫细胞丰度比之间的相关性，以阐明免疫细胞丰度比在总生存期中的潜在作用，生存分析结果表明M0巨噬细胞之间存在显著负相关，而单核细胞、活化NK细胞和嗜酸性粒细胞可预测阳性总生存期（图A-F）。         

2、与生存相关免疫细胞相关的临床数据

为确定免疫细胞对GBM临床特征的影响，作者下载相关GBM临床数据，探讨与生存相关免疫细胞丰度比值的相关性。临床特征包括年龄、性别、表达亚类和MGMT启动子状态。单核细胞和嗜酸性粒细胞的比值比在神经型和神经前型中增加，男性高于女性。

3、免疫相关基因的筛选

作者将免疫相关基因分为GBM中的高表达组和低表达组，火山图显示了4种存活相关免疫细胞的独特基因表达谱，在单核细胞中共鉴定出1107个基因，巨噬细胞M0中共鉴定出1137个基因，活化NK细胞中共鉴定出1742个基因，嗜酸性粒细胞中共鉴定出1336个基因（图A-D），维恩图呈现4种免疫细胞浸润中表达的38个相同基因（图E）。

4、免疫相关基因的功能富集分析

GO分析发现，免疫相关基因在神经系统发育、细胞粘附、细胞外基质组织和化学突触传递的生物学过程中显著富集（图A），细胞组分中的基因主要富集在质膜、胞外外泌体、胞外间隙和胞外区（图B），分子功能中的基因富集在蛋白结合、钙结合、细胞骨架的结构组成和微管结合（图C）；KEGG分析发现免疫相关基因与细胞粘附分子、cAMP信号通路、白细胞跨内皮迁移、蛋白消化吸收、Toll样受体信号通路相关联（图D），这些结果证明基因与肿瘤微环境的细胞外基质和细胞相互作用有关。

5、基于PPI网络的模块化分析

考虑到PPI网络在基因数量方面的局限性，作者筛选了所有差异表达基因，但选择了至少两个免疫细胞中共表达的基因。总的来说，作者从4122个基因中鉴定出920个基因。将这些基因导入在线STRING工具，阐明免疫相关基因的相互作用，最后得到了具有357个基因的PPI网络，组合评分设定为≥0.4（图A），并选择了最重要的模块进行进一步的功能分析（图B）。

6、与生存相关的Hub基因的识别

根据临界值标准，从PPI网络中共鉴定出模块中具有高连通性的24个hub基因，其中6个hub基因与生存率显著相关，GRIA1、BST2、B2M、TRIM21与总生存期呈正相关，而GRIA2和MAP2与不良预后相关（图A-F）。

使用Person相关性分析24个hub基因和22个免疫细胞之间的关系，在肿瘤免疫评估资源中验证了免疫细胞类型的浸润水平与生存相关hub基因之间的显著关系，结果表明CD8+ T细胞、中性粒细胞和树突状细胞的浸润水平与GRIA1、GRIA2和MAP2显著相关， BST2和B2M与B细胞、巨噬细胞和树突状细胞相关，TRIM21与B细胞和中性粒细胞相关(图A-B)。

7、CGGA数据库验证免疫相关细胞，单细胞测序数据验证免疫相关基因

作者从CGGA数据库下载134例GBM样本的免疫细胞基因表达数据，探讨从TCGA数据库中鉴定的免疫细胞的意义，结果显示活化的NK细胞和单核细胞与阳性预后相关，这与之前从TCGA数据库中获得的数据一致。作者确定hub基因的预后价值后，分析了GBM中生存相关hub基因与免疫细胞浸润的相关性，将细胞分为恶性和非恶性细胞类型，且高表达标记物分为巨噬细胞、T细胞、少突胶质细胞等非恶性细胞，A1F1、C3AR1、FCGR1A、MNDA、HMOX1、TLR2仅在巨噬细胞中表达，B2M、CCT3、HSPA8、TUBA1A在4种细胞簇中均有明显表达。参照生存相关基因，在巨噬细胞、T细胞和恶性细胞中检测到BST2；GRIA1和GRIA2在少突胶质细胞和恶性细胞中表达；MAP2仅在恶性细胞中检测到；然而，在任何细胞类型中均未检测到TRIM21。

结论：

肿瘤微环境中浸润的免疫细胞和其他基质成分与GBM的预后相关，本研究发现了24个浸润肿瘤微环境的免疫相关基因，可作为新的生物标志物和免疫治疗靶点。

参考文献：

Sicong Huang, Zijun Song, Tiesong Zhang, et al. Identification of Immune Cell Infiltration and Immune-Related Genes in the Tumor Microenvironment of Glioblastomas. Front Immunol. 2020.