与癌症的纠缠——33.883分的m6A对肿瘤免疫的介导

N⁶ -甲基腺苷（m⁶A）是最常见的RNA修饰被认为是结直肠癌（CRC）重要的上转录机制癌症。结直肠癌是全球范围内癌症发病率和死亡率的主要原因之一。本研究目的是探索肿瘤内生性m6A修饰是否以及如何驱动通过甲基转移酶样3 （METTL3）介导CRC的免疫结构。结果证实，在CRC细胞中METTL3的沉默可以减少MDSCs积累，最终抑制ApcMin/+Mettl3+/-小鼠、CD34+人源化小鼠和同基因的小鼠模型中CD4+和CD8+ T细胞的活化和增殖。这项研究强调，在结直肠癌中靶向METTL3可提高ICB治疗结直肠癌的疗效。本研究于2022年6月发表在《Gastroenterology》IF: 33.883期刊上。

技术路线：

主要研究结果：

1、  METTL3缺失可抑制结直肠肿瘤的发生，减少MDSCs积累

与野生型同窝小鼠相比，在ApcMin/+小鼠模型7中，METTL3杂合敲除小鼠（METTL3+/ -）的肿瘤明显减少。结果表明，METTL3耗尽显著降低了MDSCs，但增加了CD4+和CD8+ T细胞（图1A和1B），推断在METTL3缺失时抗肿瘤活性提高。一致地，ApcMin/+Mettl3+/-小鼠结肠组织中通过免疫组化（IHC）染色与ApcMin/+小鼠比较，发现CD8+细胞水平较高（图S1C）。为了解免疫反应的改变，研究对ApcMin/+和ApcMin/+Mettl3+/-小鼠结肠组织中炎性细胞因子的表达趋化因子及其相应的受体。METTL3耗尽抑制促炎细胞因子IL6、TNF-α、C4B、CXCL1、NOS2和IL1B mRNA表达（图1C）。通过附加的ApcMin/+和qPCR验证了这一点ApcMin/+Mettl3+/-小鼠样本（图1D）。研究进一步采集外周血单核细胞（PBMCs）用于细胞因子23-Plex免疫测定（图1E）。值得注意的是， CXCR2配体、MDSCs关键趋化因子CXCL1的血清水平为与ApcMin/+小鼠相比，ApcMin/+Mettl3+/-小鼠显著降低（P< .05，图1 F）。因此，METTL3可以调节抗肿瘤免疫。

图1 METTL3可以调节抗肿瘤免疫。

2、  METTL3敲除可诱导CRC异体移植物抗肿瘤免疫反应

为了验证METTL3在抑制CRC抗肿瘤免疫中的潜在作用，作者用CRISPRCas9敲除CT26和MC38两种小鼠CRC细胞系中的METTL3 （M3KO） （图2A）。MC38-M3KO同种异体移植瘤体积和重量显著高于对照组与MC38-NC组相比降低（图2B）。通过分析免疫细胞在肿瘤、PBMC和脾脏中，研究观察到抗肿瘤免疫增强在携带MC38-M3KO同种异体移植的小鼠中，MDSCs显著减少，特别是粒细胞样MDSC （G-MDSC）伴CD4+和CD8+ T升高细胞（图2）。此外，观察到增加的干扰素γ （IFN-γ）+和肿瘤坏死MC38-M3KO异体移植物中因子α （TNF-α）+ CD8+ T细胞增加细胞毒性t细胞活化（图2E）。为了证明研究的发现，接下来建立了原位结直肠癌模型。小鼠接受右旋糖酐钠治疗在MC38细胞定植前诱导一过性结肠损伤。通过活体啮齿动物结肠镜检查，确定MC38同种异体移植物接种成功（图2 G）。沉默METTL3可显著降低肿瘤数量和肿瘤负荷在小鼠结肠中（图2H）。此外，小鼠体内存在MC38-M3KO与对照组小鼠相比，同种异体移植小鼠PBMC中的MDSCs显著减少（图2）。研究结果共同表明METTL3缺失增强抗肿瘤免疫抑制CRC生长。

图2  沉默METTL3可恢复抗肿瘤免疫。

3、表达METTL3的CRC细胞通过分泌CXCL1招募MDSC

为了揭示METTL3促进CRC免疫抑制的机制，对MC38-NC和MC38-M3KO细胞进行RNA-seq（图3A）。在MC38敲除METTL3后，1612个基因表达下调，1428个基因表达下调上调（图3A）。值得注意的是，敲除METTL3与下调白细胞跨内皮迁移和细胞因子-细胞因子受体相互作用途径可能与癌症或免疫细胞相互作用有关（图3B）。基因中细胞因子-细胞因子受体相互作用途径，CXCL1、CXCL10显著降低和CCL2在MC38-M3KO细胞中表达（图3C） qPCR也证实METTL3敲除抑制CT26和MC38细胞中CXCL1、CXCL10和CCL2 mRNA的表达（图3D）。相反，CT26中METTL3的异位表达起到相反的作用（图3E）。在APCmin/+Mettl3+/-组血清CXCL1水平显著降低与APCmin/+小鼠比较（图1F）。ELISA检测结果表明敲除METTL3可显著减少细胞培养上清中CXCL1的分泌在CT26和MC38细胞中（图3F），以及在含有CT26和MC38细胞的小鼠血清中MC38同种异体移植（图3G）。因此，METTL3促进CRC中CXCL1的表达。CXCL1是趋化刺激因子通过与受体CXCR2结合，将MDSC招募到肿瘤微环境中。因此，推测METTL3可以通过CXCL1的分泌促进MDSCs的招募。

图3  METTL3通过CXCL1-CXCR2轴招募MDSCs。

4、METTL3在CRC中促进m⁶A-BHLHE41驱动CXCL1转录

METTL3是m6A甲基化的主要甲基转移酶。阐明METTL3依赖的m6A修饰与CXCL1表达之间的联系，m6A-seq是在MC38-NC和MC38-M3KO细胞中进行（图4A）。研究检测到9477和9092m6A峰值分别出现在MC38-NC和MC38-M3KO中，主要位于编码区序列区（CDS）和三素数非翻译区（3 ' -UTR）密度较大停止密码子周围的峰值（图4B）。m6A以GGAC为标识（图4 B）。这些潜在的METTL3靶点是在多种信号通路中富集，尤其是在DNA转录方面（图4C）。因此，通过RNA-seq鉴定，因此，通过RNA-seq鉴定，METTL3敲除细胞中有1612个下调转录本用于Pscan识别149个过代表转录因子（RNA-seq）和289个METTL3靶点（m6A-seq）缩小到5个候选（图4D）， BHLHE41， ETS1， REST， SP4和YY1（图4 E）。MeRIP-qPCR证实他们的m6A水平显著降低在CT26和MC38细胞中敲除METTL3后（图4F）。此外，基因敲除METTL3抑制CT26和MC38细胞BHLHE41蛋白表达；而ETS1和YY1蛋白水平保持不变（SP4检测不到）（图4G）。因此，BHLHE41是METTL3潜在的下游靶点。CT26细胞中METTL3的异位表达增加了BHLHE41蛋白表达式（图4 G）。接下来询问BHLHE41是否与Cxcl1启动子结合以介导其转录。ChIP-PCR实验结果显示BHLHE41可以直接结合Cxcl1的启动子区域（图4 H）。最终，BHLHE41的敲除废除了推广METTL3对MDSC迁移的影响（图4J）。这些数据共同表明在CRC细胞中，METTL3促进m6A-BHLHE41驱动CXCL1转录。

图 4  METTL3可以促进CRC中BHLHE41蛋白表达。

5、METTL3驱动的MDSC积累抑制T细胞增殖促进CRC增长

接下来，作者研究MDSC对表达METTL3的CRC T细胞的抑制能力微环境。从CT26同种异体移植物中分离出CD11b+Gr-1+ MDSCs，然后在体外与T细胞以不同比例共培养（图5A）。此外，参与MDSC抑制功能的基因表达，包括ARG1，S100A9和TGFB1在METTL3缺失的MDSCs中显著降低CT26异体移植（图5D）。抗Gr -1抗体显著耗尽MDSCs，消除METTL3在CT26同基因模型中的促肿瘤作用（图5 E）。同样，CXCR2抑制剂SB265610也能有效地消除METTL3的诱导作用MDSC募集和CRC异体移植在体内的生长（图5F）。研究得出结论，METTL3驱动MDSC积累和抑制效能促进结直肠癌的生长。

图 5  METTL3可招募抑制性MDSC促进CRC。

6、在人源化免疫系统小鼠模型中METTL3的缺失可以增强抗肿瘤免疫并降低CRC的生长

为了证实METTL3在调节人抗肿瘤免疫应答中的作用，CD34+采用人源化小鼠模型在小鼠体内复制人体免疫系统。免疫缺陷NSG小鼠静脉注射人CD34+造血干细胞亚致死γ照射后的干细胞（图6A）。流式细胞术证实在小鼠接种肿瘤之前，人CD45+细胞包含>25%的PBMCs（图6 B）。皮下注射METTL3敲除或未敲除的HCT116细胞植入（图6C）。研究观察到METTL3缺失对HCT116肿瘤有抑制作用在CD34+人源化小鼠中生长（图6D），而在CD34+人源化小鼠中效果不明显非人性化NSG小鼠。接下来，作者比较了免疫的浸润情况METTL3敲除或不敲除HCT116肿瘤组织中的细胞（图6E），METTL3的消耗导致MDSC减少，尤其是G-MDSC的显著降低，随着CD4+和CD8+ T细胞的增加（图6F），证实了作者的发现METTL3诱导CRC的抗肿瘤免疫反应。此外，在HCT116肿瘤中敲除METTL3显著抑制BHLHE41（图6G）和CXCL1（图6H）蛋白表达。最后，METTL3蛋白表达为与原发性人结直肠癌组织中CD33+ MDSCs浸润显著相关（图6I）。总之，METTL3的沉默增强了抗肿瘤免疫抑制结直肠癌生长。

图 6  敲除METTL3诱导抗肿瘤免疫，可以抑制结直肠癌在人源化小鼠模型中生长。

7、靶向METTL3增强抗PD -1治疗抑制结直肠癌的效果

鉴于METTL3招募抑制性MDSC来促进CRC的免疫抑制，作者下一步研究了在CRC中靶向METTL3是否可以提高ICB的疗效治疗。为此，使用antiPD-1处理对照和METTL3敲除MC38异体移植物。研究发现，METTL3敲除或单独抗PD -1治疗与对照相比都能降低肿瘤尺寸和重量（图7A，7B）。重要的是，他们对MC异体移植物具有较强的抑制作用肿瘤缓解率60%（6 / 10）（图7A, 7B）。PBMC浸润MDSCs的丰度，尤其是G-MDSC，以及血清CXCL1显著增加METTL3敲除+抗PD -1处理MC38异体移植减少（图7C和7 D）。接下来，作者评估了对METTL3的药理抑制是否可以达到同样的效果的效果。STM2457是一种高效、选择性的METTL3抑制剂。同样，PBMC浸润MDSC和血清在STM2457加抗PD -1处理后CXCL1明显减少（图7G和7 H）。相反，在MC38同种异体移植物中，活化T细胞浸润率最高（图7I和7J）。综上所述，研究数据发现METTL3是CRC的潜在治疗靶点，其抑制可恢复抗肿瘤免疫，增强ICB治疗的疗效。

图 7  使用抗PD -1联合METTL3抑制CRC。

综上所述，研究证明了RNA m6A甲基转移酶的作用和机制，METTL3在CRC中抑制宿主抗肿瘤免疫应答。METTL3促进m6A-BHLHE41-CXCL1/CXCR2轴招募免疫抑制MDSCs抑制CD8+ T细胞，从而促进CRC。METTL3抑制加上抗PD-1表现了对CRC具有良好的抗肿瘤作用，强调METTL3在CRC治疗中是一个潜在的目标。

参考文献：

Chen H, Pan Y, Zhou Q, Liang C, Wong CC, Zhou Y, Huang D, Liu W, Zhai J, Gou H, Su H, Zhang X, Xu H, Wang Y, Kang W, Kei Wu WK, Yu J.（2022）.METTL3 inhibits anti-tumor immunity by targeting m6A-BHLHE41-CXCL1/CXCR2 axis to promote colorectal cancer. Gastroenterology, undefined (undefined), undefined. doi: 10.1053/j.gastro.2022.06.024.