胰腺癌治疗的新靶点——microRNA
尽管gemcitabine已被认为是晚期胰腺癌（PC）的第一个线药物，但对gemcitabine耐药的发展严重限制了这种化疗的有效性，gemcitabine耐药的潜在机制仍不清楚。本研究从体内和体外两个方面探讨了PC抵抗gemcitabine的microRNAs和ABC转运蛋白相关信号通路的潜在机制。结果表明，hsa‑miR‑3178通过RhoB/PI3K/Akt信号通路‑介导ABC转运蛋白上调促进gemcitabine耐药。这些发现提示hsa‑miR‑3178可能是克服PC中gemcitabine耐药的新的治疗靶点。本研究于2022年5月发表在《Molecular Cancer》IF：41.444期刊上。
技术路线：
主要研究结果：
1. P‑gp、BCRP和MRP1蛋白在gemcitabine耐药的PC组织和细胞中过表达
有大量的研究表明ABC转运蛋白在PC的化学治疗中起着重要的作用。在本研究中，通过IHC staining进一步证实了与gemcitabine敏感组织相比，P‑gp（P糖蛋白）、BCRP（C反应蛋白）和MRP1（多药耐药相关蛋白）在gemcitabine耐药的PC组织和细胞中过表达（图1A）。Western bloting检测进一步说明它们在gemcitabine耐药的PANC-1-GEM 细胞中的表达更高（图1B）。与胰腺上正常的组织相比，胰腺癌组织中P‑gp（P-糖蛋白）、BCRP（C反应蛋白）和MRP1（多药耐药相关蛋白）的表达水平上调（图1I-N）。根据TCGA和GTE-x数据库分析，得出与正常的组织相比，癌变组织中P‑gp、BCRP和MRP1的mRNA水平也上调（图O-Q）。作者通过Molecular docking simulation分析，暗示Gemcitabine与P‑gp、BCRP和MRP1之间具有很强的结合能力（图1C-H）。
图1 P-gp、BCRP和MRP1在gemcitabine耐药的胰腺癌组织和细胞中过表达。Gemcitabine与P-gp、BCRP和MRP1蛋白之间都具有很强的结合能力
2. hsa‑miR‑3178过表达促进体内外PANC‑1细胞gemcitabine耐药
作者先前的研究发现PC组织中has-miR-3178过表达与不良预后密切相关。为查清hsa-miR-3178在PC的gemcitabine耐药中发挥的作用，作者进行qRT-PCR实验，与健康的人胰腺上皮细胞（HPDE6-C7）或邻近的非癌变组织相比，七个胰腺癌细胞系（AsPC-1、BxPC-3、CFPAC-1、Hs766t、PANC-1、MIA PaCa2和SW1990）和PC组织中hsa-miR-3178下调，结果如图2A-C所示。作者进一步发现与gemcitabine耐药PANC-1细胞相比，gemcitabine敏感的PANC-1-GEM细胞中hsa‑miR‑3178过表达（图2D）。图2E表明在PANC-1细胞中，与对照组相比，hsa-miR-3178 mimics增加gemcitabine的IC50增加。
CCK-8和Edu检测发现在诱导hsa-miR-3178表达的PANC-1细胞通过增加细胞增殖能力展示了对gemcitabine显著抗性（图2F，G）。作者们通过流式细胞术发现转染了hsa-miR-3178 mimics组的细胞凋亡百分比远远低于对照组（图2H）。最后，作者又构建了BALB/c裸鼠移植瘤模型证实这一结论（图2I-K），hsa‑miR‑3178过表达促进体内外的PANC‑1细胞gemcitabine耐药。
图2 hsa‑miR‑3178过表达促进PANC‑1细胞增殖和gemcitabine耐药
3. 下调hsa‑miR‑3178抑制体内外PANC‑1‑GEM细胞增殖和增强细胞对gemcitabine的敏感性
作者通过转染hsa-miR-3178 inhibiting vector至PANC-1-GEM细胞来探索hsa-miR-3178在体内药物治疗中发挥的作用。转染hsa-miR-3178 inhibiting vector后，PANC-1-GEM细胞中gemcitabine的IC50值比未转染的显著减小（图3A）。CCK-8和Edu检测发现hsa-miR-3178表达下调的PANC-1-GEM细胞增殖能力显著提升，并且增强对gemcitabine的敏感性（图3B，C）。作者采用流式细胞术发现与转染hsa-miR-3178mimics的PANC-1-GEM细胞相比，转染hsa-miR-3178 inhibiting vector的PANC-1-GEM细胞凋亡数量增多（图3D）。
作者分别转染antagomir-3178和antagomir阴性对照的BALB/c裸鼠建立了体外移植瘤模型，表明antagomir-3178显著减少移植瘤的重量，并且gemcitabine治疗后显著减缓肿瘤的生长（图3E-G）。
图3 下调hsa‑miR‑3178抑制体内外PANC‑1‑GEM细胞增殖和增强细胞对gemcitabine的敏感性
作者采用四种生物信息学算法（miRWalk、miRanda、RNA22和Targescan），与来自gemcitabine耐药数据集GSE80617的PANC-1-GEM细胞中的下调基因进行交叉，得到了RhoB和HIST2H2BE两个基因。通过文献调查发现RhoB具有胰腺癌促进因子的生物学功能。于是作者查找TCGA数据库中PC病人的RhoB和hsa-miR-3178的表达，发现RhoB的表达与hsa-miR-3178呈负相关（图4A）。Western blotting检测分别导入hsa-miR-3178 mimics的PANC-1细胞和导入hsa-miR-3178 inhibitor的PANC-1-GEM细胞，结果表明上调hsa-miR-3178抑制RhoB的表达，下调hsa-miR-3178促进RhoB的表达（图4B）。作者构建hsa-miR-3178 mimics、mimics NC和RhoB的野生型3 ' -UTR和突变型3 ' -UTR质粒（图4C），双荧光素酶实验结果表明，共转染has-miR-3178 mimics质粒和野生型质粒，与转染突变质粒相比，荧光素酶活性显著降低（图4D）。这些结果提示，hsa-miR-3178可能通过直接靶向RhoB的3 ' -UTR来抑制RhoB的表达。作者对含有87例PC组织芯片进行IHC检测，实验示意图如图4E所示，Kaplan - Meier survival分析显示RhoB过表达与病人有一个良好的总生存期显著相关（图4F）。因此，RhoB是hsa‑miR‑3178的直接靶基因。
图4 RhoB是hsa‑miR‑3178的直接靶基因
5. RhoB逆转hsa‑miR‑3178介导的PC细胞和亲本PANC-1细胞的gemcitabine耐药性
为探索hsa‑miR‑3178在PC细胞增殖和gemcitabine耐药中对RhoB的抑制作用。作者在PANC-1细胞中共转染RhoB过表达的慢病毒和hsa-miR-3178 mimics，或在PANC-1-GEM细胞中共转染RhoB siRNA和hsa-miR-3178 inhibitor。
RhoB上调可降低PANC-1细胞对gemcitabine的IC50，逆转has-miR-3178介导的PANC-1细胞gemcitabine耐药（图5A）。CCK-8和EdU assay的结果揭示RhoB过表达减少PANC-1细胞增殖，逆转PANC-1细胞中hsa-miR-3178对细胞增殖的促进作用（图5B-C）。过表达RhoB可促进PANC-1细胞凋亡，也能拮抗hsa-miR-3178对PANC-1细胞凋亡的抑制作用（图5D）。图5A-D是共转染RhoB过表达的慢病毒和hsa-miR-3178 mimics的相关结果；图6A-D是在PANC-1-GEM细胞中共转染RhoB siRNA和hsa-miR-3178 inhibitor相应的结果。两种方法分别从上调和下调两个角度阐述RhoB逆转PAN -1细胞中hsa- miR-3178介导的增殖和gemcitabine耐药。
图5 RhoB逆转PAN -1细胞中hsa- miR-3178介导的增殖和gemcitabine耐药。
图6 RhoB逆转hsa-miR-3178介导的增殖和PANC-1-GEM细胞中gemcitabine耐药。在PANC-1-GEM细胞中，siRhoB与hsa-miR-3178 inhibitor共转染。
6. hsa‑miR‑3178/RhoB轴通过调节PI3K/Akt信号通路和ABC转运蛋白管理gemcitabine耐药
作者进行Western blotting结果分析，探索参与蛋白表达的PANC-1细胞和指定处理生物PANC-1-GEM细胞的PI3K/Akt信号通路。RhoB过表达PANC-1细胞中PI3K和Akt的总表达不受影响，但减低p-PI3K、p-Akt 308 和p-Akt 473的磷酸化（图7A）。共转染RhoB和has-miR-3178 mimics降低hsa-miR-3178对PANC-1细胞中p-PI3K、p-Akt 308和p-Akt 473的表达。反之，RhoB敲低可增加p-PI3K、p-Akt 308和p-Akt 473的表达，siRhoB与hsa-miR-3178 inhibitor共转染可逆转PANC-1-GEM 细胞中hsa-miR-3178 inhibitor下调p-Akt 308和p-Akt 473的表达（图7B）。为进一步证实PI3K/Akt信号通路通过hsa-miR-3178/RhoB轴调控PC细胞增殖和gemcitabine耐药的作用。用PI3K抑制剂LY294002和PI3K兴奋剂740Y-P孵育PANC-1细胞和PANC-1-gem细胞。发现PANC-1细胞中PI3K inhibitor抑制hsa-miR-3178过表达对p-PI3K、p-Akt 308和p-Akt 473的刺激作用（图7C）。相反，在PANC-1-GEM细胞中，下调的hsa-miR-3178对p-PI3K、p-Akt308和p-Akt473的抑制作用被PI3K兴奋剂逆转（图7D）。此外，has-miR-3178过表达的PANC-1细胞在体外和体内中上调P-gp、BCRP和MRP1的表达（图7E），而hsa-miR-3178抑制剂下调体内外P-gp、BCRP和MRP1的表达（图7F）。因此，hsa‑miR‑3178/RhoB轴通过调节PI3K/Akt信号通路和ABC转运蛋白管理gemcitabine耐药。
图7 hsa‑miR‑3178/RhoB轴通过调节PI3K/Akt信号通路和ABC转运蛋白管理gemcitabine耐药
图8 本研究机制图
结论
总之，这项研究表明hsa-miR-3178/RhoB/PI3K/Akt介导的ABC转运蛋白上调在诱导胰腺癌细胞gemcitabine耐药中发挥重要作用（图8）。靶向Hsa-Mir-3178/RhoB可能代表了一种潜在的治疗策略来规避ABC转运蛋白介导的gemcitabine耐药用于PC治疗。
参考文献
Gu J, Huang W, Wang X, Zhang J, Tao T, Zheng Y, Liu S, Yang J, Chen ZS, Cai CY, Li J, Wang H, Fan Y.(2022) Hsa-miR-3178/RhoB/PI3K/Akt, a novel signaling pathway regulates ABC transporters to reverse gemcitabine resistance in pancreatic cancer. Mol Cancer. 21(1):112. doi: 10.1186/s12943-022-01587-9.