踏上circRNA的潮流，探索骨肉瘤的新型治疗措施

环状RNA（circRNA）是一类特殊的非编码RNA分子，在许多疾病中发挥着重要的调控作用。而难治性转移性骨肉瘤（OS）标准治疗的临床疗效不理想，新兴的抗血管生成方案仍处于婴儿期。本研究发现circFIRRE是OS肿瘤发生和血管生成的主要调控因子，并从体外和体内初步验证YY1-circFIRRE-miR-486-3p / miR-1225-5p-LUZP1通路在OS中的调控作用。这些结果提示circFIRRE能够作为一种新的预后生物标志物和难治性OS的治疗靶点。本研究于2022年8月发表在《Molecular Cancer》IF：41.444的期刊上。

技术路线：

主要研究结果：

1.      circFIRRE在OS样品和细胞中的筛选和表征

作者通过rRNA-depleted RNA-seq分析四对OS组织和正常相邻样本的circRNA表达图谱。表达异常的circRNA以火山图的形式展现在图1A中。作者选出前五个表达上调的circRNA，分别是circRUNX2（hsa_circ_0003563）、circSATB2（hsa_circ_0003915）、circFIRRE（hsa_circ_0001944）、circAFF2（hsa_circ_0001947）和circBBS9（hsa_circ_0003162）。然后开展对16对样本中的这五种异常表达的circRNA进行RT-qPCR分析工作。结果发现circFIRRE因OS组织和邻近的组织差异最大而差异表达最显著（图1B）。扩大样本量至104对匹配的临床OS样本和邻近正常样本，RT-qPCR分析结果显示，circFIRRE表达显著上调（图1C）。另外，FISH实验使用五对新鲜的患者样本也证实了上调趋势（图1D）。与成骨细胞系（hFOB1.19）相比，143B、SJSA-1、HOS、U2OS和MG63这五个细胞系的circRNA表达显著上调，特别是U2OS和MG63（图1E）。circFIRRE的亚细胞定位在细胞功能中是很重要的。作者经过核质分离后的RT-qPCR分析发现细胞质中circFIRRE表达在U2OS和MG63细胞中也显著上调（图1F-G），RNA FISH实验表明circFIRRE约有80%在细胞质中，20%在细胞核中（图1H）。circFIRRE的确切大小为1096 bp，其特异的反式剪接被Sanger测序证实（图1I）。用放线菌素D处理MG63和U2OS细胞后检测circFIRRE的稳定性，发现其可以在转录上抑制RNA合成，circFIRRE的半衰期大于24小时，比linearFIRRE在转录上更稳定，linear FIRRE的半衰期小于5 h（图1J-K），circFIRRE能抵抗RNase R酶的消化，而FIRRE在处理后很容易降解（图1L-O）。这些结果提示circFIRRE可以在OS细胞中持续稳定表达，也可能成为诊断或预后预测的生物标志物。

考虑到反剪接可能来自反式剪接或基因组重排，因而采用琼脂糖凝胶电泳（AGE）排除基因组重排的可能性。circFIRRE和linearFIRRE分别用发散引物和收敛引物在OS细胞的cDNA和基因组DNA提取物中扩增。AGE检测发现circFIRRE只存在于cDNA中，而不存在于基因组DNA中（图1P-Q）。

图1 识别和验证OS组织和细胞中下调的circFIRRE。

2.      circRNA上调预示OS病人的肿瘤转移风险更大和不良预后

为评估总生存期（OAS）和无病生存期（DFS）的危险因素，作者进行采单因素和多因素分析。单因素分析显示，年龄、手术方式、肿瘤转移和circFIRRE高表达与OAS和DFS相关。在这些变量中，多因素分析显示年龄、手术方式、circFIRRE转移和表达升高是OS患者预后的独立危险因素（图2A-D）。此外，Kaplan-Meier生存曲线显示circFIRRE高表达组的OAS和DFS比circFIRRE低表达组更低（图2E-F）。circFIRRE的高表达水平与较短的生存期、较差的临床结果和较高的风险评分呈正相关（图2G）。以上结果说明circFIRRE可作为OS患者的独立危险因素，参与OS的进展和转移。 

图2 确定circFIRRE作为预测OS预后的独立危险因素。

3.      circFIRRE促进体外OS的进展

为调查OS的生物状态的标志，作者们展开特征基因集的GSEA分析。在MG63和U2OS中建立circFIRRE稳定敲除细胞系（图3A）。然后，作者们执行CCK8和EdU检测OS细胞增殖能力。结果显示，与阴性对照细胞相比，sh-circFIRRE细胞增殖及EdU结合显著降低（图3B-F）。Transwell迁移和侵袭实验中，circFIRRE下调降低OS细胞迁移和侵袭的能力（图3G-I）。流式细胞术评估细胞周期，发现sh-circFIRRE细胞被阻滞在G0/G1期，表明circFIRRE敲低可促进细胞周期阻滞。这些说明circFIRRE敲低体外抑制OS肿瘤生长和活性。RT-qPCR验证过表达效率，并证实转染不影响linearFIRRE表达（图3J）。CCK8和EdU分析显示circFIRRE过表达显著促进MG63和U2OS增殖（图3K-O）。这些说明circFIRRE参与体外OS的生长、迁移和侵袭。

图3 体外circFIRRE影响OS的生长、迁移和侵袭。

4.      circFIRRE诱导血管生成

作者推测circFIRRE在OS肺转移中可能参与血管生成。为验证猜想，作者对转移性OS组织内皮细胞中circFIRRE是否富集进行研究。作者们从局限性骨肉瘤患者和三个临床转移性骨肉瘤患者的样本中获得原发性内皮细胞，通过CD31+磁珠分选，检测circFIRRE在内皮细胞中的差异表达（图4A）。RT-qPCR分析显示，相对于非转移性OS中的内皮细胞，转移性OS中的circFIRRE显著上调（图4B），揭示其在血管生成和OS转移中的潜在作用。三种常见的内皮细胞系（HUVEC，EA.hy926，hmec1），HUVEC细胞circFIRRE表达水平最高。因此，作者选择HUVEC进行血管生成研究。将三个circFIRRE靶向siRNAs转入HUVEC细胞，发现si-1和si-2具有较好的敲低效果，降低50%以上的circFIRRE表达水平（图4D）。si-1和si-2将用作后面的功能实验。tube formation assay再次验证，与对照组相比，si-circFIRRE显著降低HUVEC细胞的增殖、迁移和管形成能力（图4E-F）。主动脉环检测显示，si-circFIRRE转染的主动脉环在胶原中包埋7天，微血管面积较正常组小（图4G）。CAM是一种血管高度分化的鸡胚外膜，si-circFIRRE共孵育后新形成的血管明显受损（图4H）。这些结果表明circFIRRE下调显著抑制血管生成。对新芽进行tube formation assay，结果显示circFIRRE过表达显著增加HUVEC细胞的分支点和毛细血管长度（图4I-J）。CAM和主动脉环实验表明circFIRRE也能促进血管生成（图4K-L）。上述这些结果说明circFIRRE可促进肿瘤转移时的新生血管形成。

图4 circFIRRE诱导体内、体外肿瘤转移时的新生血管形成。

5.      YY1调控OS中circFIRRE的表达

鉴于circFIRRE在OS中显著上调，作者们假设circFIRRE在人类OS发育中受上游转录因子（TF）调控。作者从UCUS基因浏览器中检索到FIRRE的启动子，用三种算法来预测能与启动子结合的潜在的TFs，发现Yin Yang 1（YY1）是这些算法中唯一的转录因子（图5A）。然后检测了35对OS样本中YY1的表达水平，发现相对于相邻的正常对照，circFIRRE在OS样本中高表达，并且与circFIRRE的表达水平呈正相关（图5B-C）。在细胞水平上，相比于hFOB1.19细胞，MG63和U2OS细胞YY1表达相对上调（图5D）。随后，作者将circFIRE的启动子序列与JASPAR中的YY1结合基序进行比对，预测circFIRE启动子中2个可能的YY1结合位点（图5E），并利用双荧光素酶报告基因实验验证了2个可能的结合位点。在野生型（WT）组中，过表达YY1后，circFIRRE启动子的荧光素酶活性增强，而结合位点1或2的突变部分挽救了这种增强效应，而同时突变结合位点1和2时，荧光素酶活性没有显著变化（图5F）。为探究YY1对circFIRRE和linearFIRRE表达变化的影响，作者设计了3条YY1的siRNA，并选择敲低效果较好的si-YY1-1进行后续实验（图5G）。YY1敲低后，circFIRRE在MG63和U2OS中的表达显著下调，而线性FIRRE表达下调幅度最小，说明两组间无显著性差异（图5H-I），YY1过表达是相反的结果（图5J-L）。这些结果表明YY1的转录调控作用很可能主要是针对circFIRRE，而不是对线性FIRRE的调控。即：YY1可能是OS中circFIRRE转录的激活因子。

图5 YY1激活circFIRRE转录。

6.      circFIRRE在OS细胞中海绵miR-486-3p和miR-1225-5p

鉴于circFIRRE主要在细胞质中表达，作者推测circFIRRE可能作为miRNA海绵中和miRNA介导的基因沉默。首先，针对RNA诱导沉默复合物（RISC）的核心成分AGO2（氩气RISC催化组件2）蛋白进行RNA免疫沉淀。结果显示，circFIRRE被AGO2 pull down特异性富集，而非免疫球蛋白G（IgG）（图6A-C），提示circFIRRE可能与RISC结合并海绵化相应的miRNA。然后应用了五种算法预测circFIRE的潜在靶miRNA，并从数据库间的重叠中确定miR-486-3p和miR-1225-5p为候选miRNA（图6D）。RT-qPCR检测circFIRRE对miR-486-3p和miR-1225-5p表达水平的影响。结果表明，这两个miRNAs在35个配对的OS样本和细胞系中相对于邻近的正常对照和成骨细胞的表达显著下调（图6E），并且与circFIRRE表达呈负相关（图6H-I）。FISH实验进一步证实了这种模式（图6F-G）。然后，通过circFIRRE敲低（si-circFIRRE-1）显著上调miR-486-3p和miR-1225-5p的表达水平，反之下调miR-486-3p和miR-1225-5p的表达水平（图6J-K）。这些结果表明miR-486-3p和miR-1225-5p在OS中相对低表达，并受circFIRRE的负调控。

此外，利用特异性生物素标记的circFIRRE探针，通过pull-down实验研究circFIRRE是否可以直接结合这两个miRNAs。结果发现，相对于寡核苷酸探针，circFIRRE探针能够特异性富集细胞裂解液中的circFIRRE、miR-486-3p和miR-1225-5p（图6L-M）。pull-down实验进一步验证，与对照探针相比，特异性生物素标记的miR-486-3p和miR-1225-5p探针成功捕获circFIRRE（图6N-O）。将荧光素酶报告质粒与miR-486-3p或miR-1225-5p mimic共转染HEK-293T细胞，进行双荧光素酶报告实验。结果显示，与阴性对照miRNA相比，miR-486-3p和miR-1225-5p协同将荧光素酶活性至少降低50%。随后从荧光素酶报告质粒中突变预测的miRNA结合位点，发现miRNA转染后突变的荧光素酶活性保持不变（图6P）。在MG63和U2OS细胞中，circFIRRE与相应的miRNAs通过双重FISH实验共定位，支持了上述结果（图6Q-R）。所有这些发现表明circFIRRE可能作为miR-486-3p和miR-1225-5p的海绵发挥作用。

图6 circFIRRE充当miR-486-3p和miR-1225-5p的海绵。

7.        体外circFIRRE通过miR-486-3p和miR-1225-5p-LUZP1轴促进骨肉瘤发生和新生血管形成

基于以前的研究，作者推测circFIRRE可能通过抑制两种miRNA的保护作用，激活下游基因，促进骨肉瘤进展和新生血管形成。作者首先寻找miR-486-3p和miR-1225-5p在OS中的靶基因。通过3种预测算法（miRDB、TargetScan和RNAInter）和RNA-seq数据交叉分析，发现LUZP1（亮氨酸拉链蛋白1）是重叠基因中唯一的预测基因（图7A）。RT-qPCR验证正常邻近样本相比，LUZP1在35对临床OS样本中上调（图7B），发现它们与miR-486-3p和miR-1225-5p表达水平呈负相关，与circFIRRE呈正相关（图7C-E）。作者将荧光素酶报告质粒与miR-486-3p和miR-1225-5p mimic共转染至HEK-293T细胞，研究这两个miRNAs与LUZP1之间的相互作用。LUZP1 3′-UTR降低的荧光素酶活性伴随着miRNA的过表达。相反，与LUZP1 3′-UTR突变后的对照相比，荧光素酶活性保持不变（图7F）。研究采用RT-qPCR和Western blot进行拯救实验。结果显示，si-circFIRRE-1引起的内源性LUZP1下调在mRNA和蛋白水平被miR-486-3p或miR-1225-5p抑制剂部分挽救（图7G-H）。Wound healing assay和Transwell迁移和侵袭实验表明，miR-486-3p和miR-1225-5p抑制剂明显消除对sh-circFIRRE-1细胞迁移和侵袭的抑制作用（图7I-J）。此外，tube formation assay显示miR-486-3p和miR-1225-5p抑制剂明显增加了si-circFIRRE-1细胞中减少的分支点和毛细血管长度（图7K-L）。总之，这些发现表明circFIRRE在体外至少部分通过miR-486-3p / miR-1225-5p-LUZP1通路促进OS进展和新生血管形成。

图7 体外circFIRRE通过miR-486-3p和miR-1225-5p-LUZP1轴促进骨肉瘤发生和新生血管形成。

8.      circFIRRE通过海绵化miRNA促进OS肿瘤的原位发生和体内转移

为验证circFIRRE-miR-486-3p / miR-1225-5p轴在体内的功能，研究构建原位异种移植瘤模型和尾静脉转移模型。将荧光染料标记的MG63细胞注入右胫骨骨髓腔，建立原位异种移植瘤模型（每组10个）。荧光素酶强度显示circFIRRE敲低明显降低原位肿瘤大小，抑制骨肉瘤细胞增殖，而miR-486-3p和miR-1225-5p抑制减轻这种损伤（图8A）。在注射后5周进行micro-CT扫描和三维重建以评估肿瘤发生引起的骨破坏情况。结果表明，对照组出现严重的胫腓骨和关节破坏，sh-circFIRRE组骨破坏减轻，而miR-486-3p和miR-1225-5p海绵拯救了sh-circFIRRE的修复（图8B）。注射后5周，处死小鼠，获取OS病灶进行免疫组化（IHC）和蛋白分析。IHC结果显示，细胞增殖标志物ki-67显示肿瘤增殖活性减弱，间质标志物N-cadherin和显示EMT能力受到抑制。在shcircFIRRE-1组中Vimentin和上皮标志物E-cadherin，而这些肿瘤特征被miRNA海绵拯救（图8C）。在sh-circFIRRE-1组中观察到LUZP1的蛋白水平相对于对照组下调，而在IHC和Western bolt分析中抑制miR-486-3p和miR-1225-5p部分消除了下调（图8D-E）。

为了进一步研究circFIRRE如何调节肿瘤肺转移和血管生成，作者通过将稳定的荧光素酶标记的MG63细胞注射到裸鼠的侧尾静脉中（每组10只小鼠），构建肺转移模型。注射后4周，根据IVIS实验中荧光素酶的强度，发现对照组小鼠肺野内有弥漫性转移；sh-circFIRRE组的肺区相对清晰，无广泛转移；与sh-circFIRRE组相比，沉默miR-486-3p和miR-1225-5p显著增加了肺转移的程度和转移病灶的大小（图8F）。同样，micro -CT扫描和三维重建显示，与对照组相比，sh-circFIRRE组的肿瘤体积和数量显著减少（图8G-I），而与sh-circFIRRE组相比，sh-circFIRRE和miRNAs海绵组的转移病灶体积和数量增加。切除的肺在光照和苏木精和伊红染色下的照片进一步证实这一结论（图8J-K）。转移OS中VEGF和CD31染色显示，对照组和miRNAs海绵组的血管生成均被显著激活，而在sh-circFIRRE-1组中血管生成被抑制（图8L-M）。IHC和Western blot验证转移灶中LUZP1表达的相应变化（图8N-O）。所有这些发现表明circFIRRE通过在体内吸附miR-486-3p / miR-1225-5p促进骨肉瘤的原位生长、肺转移和血管生成。

图8 circFIRRE通过海绵化miRNAs促进OS肿瘤的原位发生和体内转移。

结论

总之，与相邻的正常样本相比，OS患者样本中circFIRRE表达上调。circFIRRE表达升高与不良临床表现呈正相关。体外和体内初步验证了YY1-circFIRRE-miR-486-3p/ miR-1225-5p-LUZP1通路在OS中的调控作用。研究首次阐明circFIRRE在OS肿瘤发生和血管生成中的作用，可能为难治性OS等肿瘤中circRNAs的分子生物学、诊断和治疗研究提供有用的参考。

参考文献

Yu L, Zhu H, Wang Z, Huang J, Zhu Y, Fan G, Wang Y, Chen X, Zhou G. (2022) Circular RNA circFIRRE drives osteosarcoma progression and metastasis through tumorigenic-angiogenic coupling. Mol Cancer. 21(1):167. doi: 10.1186/s12943-022-01624-7.