LncRNA DACH1通过与SRSF1结合抑制CTNNB1积累来防止肺纤维化

肺纤维化是多种肺部疾病的终末期结果，其特征是成纤维细胞过度增殖、异常细胞外基质 (ECM) 沉积伴有炎症损伤和组织结构破坏。最常见的疾病类型是特发性肺纤维化 (IPF)，这是一种严重的间质性肺疾病，会导致肺功能进行性丧失，由于其严重的临床表现、预后不良和高死亡率导致重大医疗负担。IPF的分子机制尚不完全清楚，除肺移植外，IPF尚缺乏有效的治疗方法。该研究发表于《ACTA PHARMACEUTICA SINICA B》，IF: 14.903。

技术路线：

主要研究结果：

1. LncDACH1缺乏导致小鼠肺纤维化

在之前的研究中，作者生成了LncDACH1敲除 (LncDACH1-KO) 小鼠，其表现出肺中LncDACH1的显着减少。出乎意料的是，根据显微计算机断层扫描（Micro-CT，图1A）。此外，LncDACH1- KO小鼠的用力肺活量 (FVC)、用力呼气流量 (FEF)、FEV0.1、FEV0.1/FVC、吸气能力 (IC) 以及流量-容积环也有所减弱（图1B)，说明LncDACH1与小鼠肺功能密切相关。作者进一步检测到LncDACH1的缺失会诱导Fn1、Col1a1、Col3a1和Acta2的mRNA水平，以及与肺纤维化相关的FN1和胶原蛋白I的蛋白表达（图1C和D)。羟脯氨酸在胶原蛋白中含量最丰富，这一指标因敲除LncDACH1而升高（图1E)。在肺组织切片上使用H&E染色和Masson三色染色，作者观察到LncDACH1的敲除促进了胶原沉积并增加了纤维化面积（图1F和G)。与这些结果一致，免疫组织化学和免疫荧光证实了LncDACH1-KO小鼠肺中胶原蛋白I和α-SMA的表达上调（图1H-K），表明LncDACH1缺陷小鼠表现出自发性肺纤维化。

图1 LncDACH1的缺失导致小鼠肺纤维化

为了评估LncDACH1在肺纤维化中的作用，作者检测了LncDACH1在肺瘢痕灶中的表达。qRT-PCR分析显示LncDACH1的表达在IPF患者的肺组织和BLM治疗的小鼠中下调。

考虑到细胞的异质性，作者对从IPF和正常肺中分离的细胞进行了scRNA-seq分析。首先，IPF Cell Atlas ( http://ipfcellatlas.com/ ) 分析了GSE135893数据集。基于相对相似性，形成了四种细胞类型组：上皮细胞、内皮细胞、间充质细胞和免疫细胞。作者发现LncDACH1保守序列DACH1的表达在成纤维细胞中高于AT2细胞。来自人类蛋白质图谱网站 ( https://www.proteinatlas.org/ ) 的ScRNA-seq结果显示DACH1在内皮细胞、粒细胞和成纤维细胞中高度表达。与体内结果一致，在从BLM诱导的成年小鼠分离的肺成纤维细胞和TGF-β1诱导的原代小鼠肺成纤维细胞 (PMLF)中，LncDACH1的表达均显着降低。

2. LncDACH1的过表达减轻了TGF-β1诱导的小鼠肺成纤维细胞纤维化

为了进一步了解LncDACH1是否作用于成纤维细胞，作者构建了LncDACH1质粒以成功增强LncDACH1在PMLF中的表达（图2A）。TGF-β1诱导的PMLFs 中Fn1、Col1a1、Col3a1和Acta2的mRNA表达上调，但在LncDACH1过表达后这些改变被逆转（图2B）。同时，LncDACH1转染的PMLFs中FN1和胶原蛋白I的蛋白表达低于TGF -β1诱导的细胞（图2C）。由于成纤维细胞的激活是肺纤维化的一个重要特征，作者评估了LncDACH1对PMLF功能的调节作用。根据EdU荧光染色，LncDACH1被证实可抑制由TGF-β1诱导的细胞增殖增加（图2D)。伤口愈合试验的结果表明，LncDACH1抑制肺成纤维细胞的迁移能力（图2E)。免疫荧光染色还显示，在LncDACH1的存在下，成纤维细胞向α- SMA 阳性肌成纤维细胞的转变减弱（图2F）。

图2 LncDACH1在原代小鼠肺成纤维细胞中的抗纤维化作用

3. LncDACH1与SRSF1结合以调节其表达和活性

lncRNA 的细胞定位很大程度上决定了它们的作用机制。因此，作者设计了FISH探针，发现LncDACH1在细胞质和细胞核中均有表达，但在生理条件下主要定位于细胞核（图3A）。最近，有研究报道lncRNAs可以直接与蛋白质结合，然后调节蛋白质的表达和活性。作者假设LncDACH1通过与核蛋白相互作用参与纤维发生。通过使用RNA结合蛋白相互作用数据库，包括RBPmap（http://rbpmap.technion.ac.il/manual.html）、RBBPB（http://rbpdb.ccbr.utoronto.ca/）和catRAPID（http ://service.tartaglialab.com/page/catrapid_group ) , 预测与LncDACH1结合的蛋白质(图3B）。在9种预测的蛋白质中，SRSF1引起了作者的兴趣，因为它主要与LncDACH保守序列结合。如图3C所示，LncDACH1-KO小鼠肺中SRSF1蛋白水平升高。转染LncDACH1过表达质粒的PMLFs抑制了TGF-β1诱导的SRSF1上调（图3D)。此外，作者使用翻译抑制剂放线菌酮以时间依赖性方式检测LncDACH1对SRSF1稳定性的影响。蛋白质分析表明，LncDACH1的过表达增强了SRSF1蛋白的降解（图3E)。这些结果表明LncDACH1不依赖蛋白酶体或泛素化来降解SRSF1。作者接下来进行了RNA下拉分析，以探索LncDACH1是否直接与SRSF1结合。正如预期的那样，在提取 RNA-蛋白质复合物后，通过蛋白质印迹检测SRSF1的蛋白质表达（图3F）。进行RNA结合蛋白免疫沉淀 (RIP) 测定以评估LncDACH1和SRSF1之间的关系。与IgG沉淀相比，作者观察到LncDACH1在抗SRSF1抗体沉淀中的富集（图3G）。此外，过表达LncDACH1明显减弱了PMLF中的SRSF1荧光（图3H）。总之，作者的结果表明LncDACH1与SRSF1结合以调节其表达。

图3 LncDACH1调节SRSF1表达

4. SRSF1是LncDACH1的抗纤维化作用所必需的

为了研究LncDACH1与SRSF1相互作用在肺纤维化中的作用，作者同时将LncDACH1过表达质粒和含有腺病毒的SRSF1过表达质粒 (Adv-SRSF1) 转染到PMLF中。在mRNA水平上，增强的SRSF1表达抑制了LncDACH1对Fn1、Col1a1、Col3a1和Acta2的负调控（图4A）。SRSF1对FN1和胶原蛋白I的蛋白表达也有促进作用（图4B)，表明SRSF1的表达恢复了LncDACH1对纤维化和胶原沉积的抑制作用。同样，与过表达LncDACH1的细胞相比，SRSF1增加的PMLF 表现出更强的增殖能力（图4C）。在TGF-β1的背景下，SRSF1阻碍了LncDACH1对细胞迁移的抑制作用，并促进了成纤维细胞向肌成纤维细胞的转变（图4D和E)。这些发现表明，SRSF1作为LncDACH1的下游靶基因，介导LncDACH1的抗纤维化作用。

图4 SRSF1的过表达限制了LncDACH1的功能

5. LncDACH1通过靶向SRSF1抑制Ctnnb1表达

先前的研究表明，SRSF1通过募集Ctnnb1 mRNA并增强其生物合成来促进β-catenin 蛋白的积累。Ctnnb1是Wnt信号通路的关键效应子，参与肺纤维化的发病机制。作者从LncDACH1-KO小鼠的肺组织中进行蛋白质印迹分析，发现β-catenin蛋白水平显着上调（图5A）。随后，作者发现LncDACH1在体外可以逆转TGF-β1诱导的β-catenin表达增加（图5B）。然而，LncDACH1对β-catenin蛋白的抑制被SRSF1过表达消除（图5C）。此外，免疫荧光染色显示，LncDACH1的强制表达抑制了TGF-β1处理的PMLFs中β-catenin的表达和核转位，而这种作用被SRSF1过表达显着减弱（图5D)。

图5 沉默Ctnnb1消除了LncDACH1缺乏的促纤维化作用

接下来，作者构建了小干扰 RNA (siRNA) 来沉默LncDACH1和Ctnnb1，并验证了它们的效率。如图5E所示，LncDACH1的沉默促进了β-catenin的表达和核转位，而这种作用被Ctnnb1敲低显着抑制。qRT-PCR结果显示，LncDACH1缺陷导致Fn1、Col1a1、Col3a1和Acta2上调，而沉默Ctnnb1则逆转上述变化（图5F）。敲低Ctnnb1可抑制由LncDACH1缺陷引起的FN1、胶原蛋白 I、SRSF1和β-catenin蛋白表达增加（图5G）。此外，敲低LncDACH1足以诱导PMLFs的增殖和迁移，而敲低Ctnnb1则消除了这种情况（图5H和I）。免疫荧光结果显示，在LncDACH1沉默的细胞中，α-SMA的表达增加，而Ctnnb1的抑制逆转了成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化（图5J)。因此，作者的数据表明，Ctnnb1是LncDACH1靶向SRSF1调节肺纤维化的关键步骤。

6. LncDACH1的增强表达可预防BLM诱导的小鼠肺纤维化

为了验证LncDACH1是否在体内发挥抗纤维化作用，作者构建了一个含有LncDACH1的腺病毒相关病毒5 (AAV-5) 过表达质粒，命名为AAV5-LncDACH1。作者在BLM诱导前14天气管内施用AAV5-LncDACH1，以观察LncDACH1对肺纤维化的预防作用。在BLM注射后第21天对小鼠实施安乐死，并获得肺组织用于后续研究（图6A）。根据qRT-PCR分析，Fn1、Col1a1、Col3a1和Acta2的 mRNA 水平被预防性LncDACH1抑制（图6B）。蛋白质印迹检测到BLM对FN1和胶原蛋白I的诱导受到AAV5-LncDACH1的阻碍（图6C）。此外，LncDACH1的下游靶标SRSF1和β-catenin也同样被下调（图6C）。与BLM处理后 AAV5-pcDNA3.1处理的小鼠相比，AAV5- LncDACH1处理的小鼠肺组织中的羟脯氨酸含量较低（图6D)。肺组织用多聚甲醛固定并进行H&E和Masson染色后，预先注射AAV5 -LncDACH1的小鼠肺组织形态和纤维化面积有明显改善，说明LncDACH1在体内抑制了纤维化发生（图6E和F)。免疫组化和免疫荧光显示，BLM诱导的胶原蛋白I和α-SMA表达增加被LncDACH1预防显着抑制（图6G-J)。这些结果说明LncDACH1在BLM诱导的肺纤维化中起保护作用。

图6 LncDACH1抑制BLM诱导的肺纤维化

7. 在已建立的小鼠肺纤维化实验模型中，LncDACH1的强制表达减弱了肺纤维化的进展

由于肺纤维化的诱因复杂，病程长，早期认识和治疗是提高生存率的有效方法。在治疗方案中，作者在BLM诱导后5天注射AAV5-LncDACH1，并在BLM气管内给药后21天处死小鼠（图7A）。在BLM诱导小鼠肺纤维化后，纤维化相关基因的mRNA和蛋白水平受到LncDACH1表达增强的抑制（图7B和C）。SRSF1和β-catenin的蛋白表达同样受到LncDACH1处理的调节（图7C）。LncDACH1处理后羟脯氨酸含量与正常对照小鼠没有明显差异，但在BLM暴露的小鼠中羟脯氨酸含量显着降低（图7D)。响应于治疗性AAV5- LncDACH1治疗，小鼠肺组织显示出较少的纤维化区域，较轻的胶原蛋白I和α-SMA 染色（图7E-J)，表明LncDACH1能够阻止肺纤维化的进展。更重要的是，作者同时在小鼠中过表达了LncDACH1和SRSF1。作者的结果表明，LncDACH1减弱了BLM诱导的小鼠纤维化，而SRSF1逆转了LncDACH1的功能。这些结果证明了LncDACH1 /SRSF1/ Ctnnb1轴的抗纤维化作用。

图7 治疗性LncDACH1对肺纤维化的抑制作用

8. LncDACH1保守序列在MRC-5细胞中的抗纤维化作用

LncDACH1在小鼠模型和原代小鼠肺成纤维细胞中表现出对肺纤维化的有效保护作用。作者希望确定LncDACH1是否对人源成纤维细胞（MRC-5细胞）也有相同的作用。由于LncDACH1过长的核苷酸序列限制了其药用潜力，作者鉴定了可能与SRSF1结合的 LncDACH1序列（800-1200）（如图3B)，基于先前的一项研究，该研究表明LncDACH1 (835–1251) 片段具有功能性且高度保守。作者通过RNA下拉试验检测到SRSF1和LncDACH1 (835-1251) 相互作用（图3H）。qRT-PCR分析显示LncDACH1 (835-1251) 在MRC-5细胞中的表达在被TGF-β1诱导后被抑制（图8A）。在纤维化方面，LncDACH1 (835-1251) 显着减轻TGF-β1增加FN1、COL1A1、COL3A1和ACTA2的mRNA表达，同时抑制FN1、胶原蛋白 I、β-连环蛋白和SRSF1蛋白水平的上调，以及效率与全长LncDACH1一致（图8B和C）。此外，作者发现LncDACH1 (835-1251) 抑制 MRC-5 细胞的迁移、增殖和分化（图8D-F)。免疫荧光分析显示LncDACH1 (835-1251)通过减少β-连环蛋白的核转位来抑制其活性（图8G）。总之，作者已经证明LncDACH1的保守序列对人胎肺成纤维细胞的活化具有改善作用。

图8 LncDACH1的保守序列对人肺成纤维细胞(MRC-5)的影响

结论：

该研究表明，LncDACH1通过与SRSF1结合并抑制SRSF1的表达来负调节CTNNB1的水平，从而抑制肺成纤维细胞的活化和细胞外基质的沉积，从而参与缓解肺纤维化的过程。因此，可以利用LncDACH1的替代来增强其表达以预防和治疗IPF。

图形摘要：

LncDACH1通过与SRSF1结合并抑制SRSF1蛋白表达负调控CTNNB1，从而抑制肺成纤维细胞的活化和细胞外基质的沉积，从而减轻肺纤维化。

参考文献：

Sun J, Jin T, Niu Z, Guo J, Guo Y, Yang R, Wang Q, Gao H, Zhang Y, Li T, He W, Li Z, Ma W, Su W, Li L, Fan X, Shan H, Liang H. LncRNA DACH1 protects against pulmonary fibrosis by binding to SRSF1 to suppress CTNNB1 accumulation. Acta Pharm Sin B. 2022 Sep;12(9):3602-3617. doi: 10.1016/j.apsb.2022.04.006. Epub 2022 Apr 16. PMID: 36176913; PMCID: PMC9513499.