CircMBOAT2通过稳定PTBP1促进FASN mRNA细胞质输出促进肝内胆管癌进展和脂质代谢重编程

FASN通过调节脂质代谢重编程的致癌作用已在多种肿瘤中得到证实。然而，肝内胆管癌（ICC）进展过程中的机制，如circRNAs，是否调节FASN的表达尚不清楚。在这里，作者证明一个脂质代谢相关的circRNA，circMBOAT2在ICC组织中频繁上调，并且与ICC的恶性特征呈正相关。机制上，circMBOAT2与PTBP1结合，保护PTBP1免受泛素/蛋白酶体依赖的降解，损害PTBP1将FASN mRNA从细胞核转移到细胞质的功能。研究结果证实，circMBOAT2在ICC中表达上调，并通过稳定PTBP1促进FASN mRNA胞质输出促进ICC进展，从而改变ICC的脂质代谢轮廓和调节氧化还原稳态，提示circMBOAT2可能作为脂质代谢活跃的ICC的治疗靶点。本研究于2023年1月发表于《Cell Death Dis》，IF：9.685。

技术路线：

主要研究结果：

1、  CircMBOAT2在ICC中上调，且与脂质代谢相关

代谢重编程是癌症的标志，ICC也不例外。作者利用RNA - seq分析7个配对ICC样本中circRNA的表达谱。在ICC组织中共鉴定出420个满足以下条件的失调circRNA：（1） |平均标准化倍数变化|≥1；（2） P值< 0.05，其中82个上调，338个下调。接下来，通过GO和KEGG通路分析对所选circRNAs的基因功能进行阐释。在KEGG通路分类分析中，'有机系统'（154个基因）和'代谢'（169个基因）类别占优势。在"代谢"类别中，"脂质代谢"包括31个基因（图1A）。此外，KEGG富集分析表明筛选的circRNA主要与代谢相关，包括"亚油酸代谢"和"花生四烯酸代谢"（图1B）。这些结果表明ICC中显著差异的circRNAs与脂质代谢相关。在与脂质代谢相关的circRNAs中，circMBOAT2在ICC肿瘤与癌旁正常组织中差异最为明显。作者随后证实ICC与正常胆管组织/细胞之间的差异表达（图1C-D）。Kaplan - Meier分析显示circMBOAT2高表达与（P = 0.055）患者较短的OS相关（图1E）。circMBOAT2由MBOAT2的第2至第3外显子产生，长度为224nt。使用发散型和收敛型引物扩增绳头插接结合位点和circMBOAT2全长，并通过Sanger测序验证（图1F）。通过circBase数据库注释PCR分析发现，circMBOAT2可以用gDNA中的发散引物、随机六聚体反转录的c DNA和oligo（dT）引物扩增。然而，circMBOAT2只能在随机六聚体反转录的cDNA中用收敛引物扩增，而不能用gDNA或oligo（dT）引物反转录的cDNA（图1G）。抗RNase R核酸外切酶消化实验证明circMBOAT2具有闭环结构（图1H）。通过核质分离和FISH发现circMBOAT2在细胞质和细胞核中均有表达（图1I-J）。这些结果表明circMBOAT2是一个在ICC中广泛分布的circRNA。

图1 CircMBOAT2在ICC中上调，且与脂质代谢相关

2、circMBOAT2促进体内外ICC进程

为研究circMBOAT2在ICC进展中的功能作用，作者检测7种细胞系中circMBOAT2的内源性表达。结果显示，circMBOAT2在QBC - 939、HCCC - 9810、RBE、CCLP1和FRH细胞中的表达高于正常胆管上皮细胞H69细胞（图1D）。由于RBE和HCCC - 9810细胞是公认的，并且是ATCC细胞库中唯一保留的两种细胞系，因此在接下来的实验中使用它们。

采用CCK-8、克隆形成、EdU细胞增殖实验和流式细胞术进一步检测敲低和过表达细胞系的生物学功能。这些结果表明，在RBE和HCCC - 9810细胞中，敲低circMBOAT2抑制细胞增殖和克隆形成，但促进细胞凋亡的早期和晚期以及GO/G1期阻滞（图2A-E）。为进一步研究敲低circMBOAT2抑制细胞增殖、凋亡和GO/G1期阻滞的机制，作者通过WB检测关键调控因子的表达水平。circMBOAT2敲低显著降低c - myc、Bcl - 2和cyclin D1蛋白水平，增加Bax蛋白水平（图2F）。

为评估circMBOAT2在体内的生物学功能，将不同克隆的RBE细胞接种于裸鼠皮下构建异种移植瘤模型。结果证实，干扰circMBOAT2的表达后，肿瘤生长明显受到抑制（图2G）。相反，与对照组相比，circMBOAT2高表达组的平均肿瘤体积和重量更大，肿瘤生长更快（图2I）。由于sh-circMBOAT2组肿瘤组织体积较小，作者取其他3组材料进行IHC染色，发现与对照组相比，上调circMBOAT2组增殖细胞（Ki67 +和PCNA +）比例增加（图2H-J）。此外，作者在32例ICC患者组织中发现circMBOAT2与Ki - 67的表达具有显著相关性（图2K）。总之，这些发现暗示circMBOAT2促进ICC生长。

图2 circMBOAT2促进体内外ICC进程

3、CircMBOAT2调节脂质代谢重编程，尤其是不饱和脂质

由于circMBOAT2表达与脂质代谢相关，从RNA-seq的分析结果来看，作者使用BODIPY493/503探针检测ICC细胞中中性脂滴含量。结果表明中性脂滴含量与circMBOAT2 的表达呈正相关（图3A-B）。通过流式细胞仪进一步证实这一点（图3C-D）。然后，作者对circMBOAT2敲低的细胞进行RNA - seq和非靶向脂质代谢组学分析，发现circMBOAT2调节ICC中的脂质代谢重编程。GSEA显示，在circ MBOAT2 KD的HCCC - 9810细胞中，不饱和脂肪酸途径相关基因的生物合成受到影响（图3E）。在GSEA分析中，作者还发现与DNA复制、细胞凋亡和细胞周期相关的基因也与circMBOAT2相关，进一步证明circMBOAT2促进ICC生长（图3E）。非靶向脂质组学鉴定出474种脂质，分属于14类（图3F）。主成分分析（PCA）结果显示，circMBOAT2 KD的HCCC - 9810细胞与阴性对照转染细胞的脂质组学差异较大（图3G）。circMBOAT2敲低的HCCC - 9810细胞中的脂质种类发生变化（图3H），不饱和脂质与饱和脂质相比发生明显的变化。因此，作者的数据表明circMBOAT2促进ICC脂质代谢重编程，尤其是不饱和脂质代谢重编程，这可能是ICC进展的一个特征。

图3 CircMBOAT2调节脂质代谢重编程

4、CircMBOAT2在ICC细胞中与PTBP1相互作用

为探索circMBOAT2是否通过与蛋白质相互作用来实现其功能，作者进行RNA pull - down实验来探索与之相关的蛋白质。RNA pull - down实验中沉淀的蛋白用10 % SDS - PAGE分离，银染检测（图4A）。利用LC-MS / MS对circMBOAT2探针下拉的蛋白进行鉴定，结果见图4B。在这些蛋白中，FASN被发现是一种脂质代谢相关蛋白，可与正义和反义探针结合。另一种RNA结合蛋白PTBP1，已被报道在多种癌症中调节糖代谢重编程，并与正义探针特异性相互作用。值得注意的是，在沉淀中没有发现AGO2，进一步证实circMBOAT2不通过ceRNA机制发挥作用。作者进行WB分析，与LC - MS / MS结果一致，PTBP1和FASN均与circMBOAT2结合（图4C）。通过RIP实验，作者证实PTBP1特异性结合circMBOAT2而不是FASN（图4D-E）。此外，作者在HCCC - 9810细胞系中进行RNA FISH免疫荧光实验，发现circMBOAT2与PTBP1在细胞质和细胞核中都存在共定位（图4F）。与circMBOAT2的亚细胞定位一致，PTBP1也主要分布在细胞核中（图4G）。这些结果表明circ MBOAT2通过与PTBP1结合发挥作用。

图4CircMBOAT2在ICC细胞中与PTBP1相互作用

5、CircMBOAT2保护PTBP1免受泛素/蛋白酶体依赖的降解

采用WB检测RBE和HCCC - 9810细胞中circMBOAT2与PTBP1的关系。结果显示，敲低circMBOAT2降低PTBP1蛋白水平，相反，过表达circMBOAT2增加PTBP1蛋白水平（图5A-B）。通过IHC，作者发现circMBOAT2和PTBP1在32例ICC患者组织中的表达具有显著相关性（图5C）。值得注意的是，在过表达circMBOAT2的情况下，FASN蛋白水平升高，表明FASN可能以间接的方式被调控（图5B）。然后作者在ICC细胞中进行PCR和WB分析，进一步检测circMBOAT2和PTBP1之间的关系。为证实circMBOAT2不影响PTBP1的RNA稳定性，作者进行RNA聚合酶II抑制剂放线菌素（ActD）追赶实验。结果显示，敲低circMBOAT2的细胞中PTBP1的mRNA水平无明显变化（图5D）。相反，用CHX处理后，作者发现敲低circMBOAT2增加PTBP1蛋白的半衰期（图5E）。因此，作者推测circMBOAT2可能通过相互作用稳定PTBP1蛋白。作者研究敲低circMBOAT2是否显著降低PTBP1蛋白水平，而这种作用可以被蛋白酶体抑制剂MG132恢复（图5F）。此外，免疫共沉淀实验发现，敲低circMBOAT2显著增加PTBP1 （图5G-H）的泛素化水平。这些结果表明circMBOAT2通过保护PTBP1免受泛素/蛋白酶体依赖的降解来增加PTBP1的稳定性。

图5CircMBOAT2保护PTBP1免受泛素/蛋白酶体依赖的降解

6、CircMBOAT2促进PTBP1介导的细胞质输出FASN mRNA

作者通过RIP实验证实PTBP1可以与FASN mRNA结合（图6A）。为研究PTBP1与FASN mRNA结合后的功能，作者使用两组siRNAs（siPTBP1 # 1和si - PTBP1 # 2）检测PTBP1敲低后FASN mRNA的水平，发现PTBP1敲低后没有显著差异（图6B）。说明PTBP1不影响FASN mRNA的稳定性。与在ICC细胞系中的表现一致，与癌旁非肿瘤组织相比，FASN的RNA水平在ICC组织和癌旁正常组织中无明显差异（图6C）。然而，FASN蛋白的表达水平与circMBOAT2显著相关（图6D）。在RBE和HCCC - 9810细胞中敲低PTBP1后，FASN的蛋白水平降低（图6E）。为研究PTBP1是否介导FASN mRNA的选择性剪接，作者从NCBI中查找FASN的剪接形式，设计含有该剪接区的引物。通过Sanger测序，作者发现敲低PTBP1后FASN的剪接形式没有改变（图6G）。因此，作者推测PTBP1可以促进FASN mRNA的胞质输出。为验证这一假设，作者进行核质分离和FISH实验。有趣的是，作者观察到PTBP1敲低后，RBE和HCCC - 9810细胞中细胞质FASN mRNA水平明显降低（图6F-I）。作者进一步研究PTBP1敲低对FASN表达的影响。PTBP1敲低消除circMBOAT2过表达对RBE中FASN表达的影响（图6J）。这些结果表明，在ICC细胞中circMBOAT2通过与PTBP1相互作用促进细胞质输出和FASN mRNA的表达。

图6CircMBOAT2促进PTBP1介导的细胞质输出FASN mRNA

7、花生四烯酸（C20：4）和肾上腺酸（C22：4）干预circMBOAT2 / PTBP1 / FASN轴的ICC进展

作者接着研究circMBOAT2在ICC进展中的作用是否依赖于FASN通路。检测si - FASN # 1、si - FASN # 2、si - FASN # 3三组siRNA的效率，均能降低FASN的表达（图7A）。效率较高的si - FASN # 2和si - FASN # 3用于后续实验。CCK - 8、Ed U细胞增殖实验和流式细胞术的体外实验表明，在RBE和HCCC - 9810细胞中，FASN表达降低抑制细胞增殖，促进早期和晚期凋亡以及GO/G1期阻滞（图7B - E）。

接下来，作者通过脂质组学比较对照、circMBOAT2沉默或FASN沉默的ICC细胞之间的脂质水平。PCA分析表明，ICC细胞中FASN的下调与circMBOAT2沉默平行（图7F）。这些数据表明circMBOAT2促进ICC进展的脂质代谢重编程功能依赖于FASN通路。因此，ICC细胞中不饱和脂肪酸尤其是多不饱和脂肪酸的水平发生显著变化。

基于偏最小二乘判别分析（PLS-DA），作者发现两种n - 6 PUFAs，花生四烯酸（C20：4）和肾上腺酸（C22：4）的比例在circMBOAT2沉默组和FASN沉默组中显著降低（图7G），因此作者探究这两种n - 6 PUFAs在FASN介导的ICC进展中的功能。在体外，CCK - 8、EdU细胞增殖实验和流式细胞术表明，FASN表达降低在功能上抑制HCCC - 9810细胞的增殖，促进细胞凋亡的早期和晚期以及GO/G1期阻滞，这种作用可以被额外的花生四烯酸和肾上腺酸补充所逆转（图8A - C）。这初步表明花生四烯酸和肾上腺酸在ICC中FASN致癌性中的可能作用。

图7花生四烯酸（C20：4）和肾上腺酸（C22：4）干预circMBOAT2 / PTBP1 / FASN轴的ICC进展

8、CircMBOAT2通过FASN降低ICC细胞氧化应激

为进一步研究circMBOAT2参与的信号通路，作者对上述组织和细胞进行RNA - seq转录组测序。KEGG通路富集分析显示circRNAs与细胞色素P450通路相关（图1B）。与之一致，circMBOAT2 - KD触发铁死亡和NF - κ B信号通路（图8D）。这些结果表明circMBOAT2参与调节ICC的氧化还原稳态。至此，作者检测HCCC - 9810细胞的脂质过氧化水平和活性氧（ROS）水平。流式细胞术结果显示，过表达circMBOAT2抑制FASN - KD诱导的脂质过氧化和ROS产生（图8E , F），这解释之前敲低FASN和circMBOAT2诱导的细胞凋亡。超氧化物歧化酶（SOD1和SOD2）、谷胱甘肽过氧化物酶1 （GPX1）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、核因子E2相关因子2 （NRF2）和血红素加氧酶1 （HO-1）的mRNA水平在FASN - KD细胞中显著升高，当circMBOAT2过表达时恢复（图8G）。此外，过表达circMBOAT2抑制FASN - KD促进的NRF2在ICC细胞中的表达（图8H）。这些结果表明circMBOAT2促进ICC的脂质代谢重编程，该过程受circMBOAT2 / PTBP1 / FASN轴的调控。

图8 CircMBOAT2通过FASN降低ICC细胞氧化应激

图9circMBOAT2促进ICC进展的工作模型。

结论

作者的研究首次提出ICC脂质代谢重编程受circMBOAT2调控，并与其进展相关。机制上，作者发现circMBOAT2结合并稳定PTBP1，从而有助于FASN mRNA的胞质输出。FASN的上调改变ICC的脂质代谢轮廓并调节氧化还原稳态。重要的是，作者的研究结果表明，沉默circMBOAT2为ICC治疗提供新的治疗策略。

参考文献

Yu X, Tong H, Chen J, Tang C, Wang S, Si Y, Wang S, Tang Z. CircRNA MBOAT2 promotes intrahepatic cholangiocarcinoma progression and lipid metabolism reprogramming by stabilizing PTBP1 to facilitate FASN mRNA cytoplasmic export. Cell Death Dis. 2023 Jan 12;14（1）:20. doi: 10.1038/s41419-022-05540-y. PMID: 36635270; PMCID: PMC9837196.