NSUN2通过m5C甲基化促进骨肉瘤的进展

m5C修饰主要由RNA甲基转移酶NSUN2诱导，是mRNA中重要的转录后化学修饰，已被证明在许多癌症的进展中发挥重要作用。然而，NSUN2介导的m5C在骨肉瘤(OS)中的作用和潜在的分子机制尚不清楚。在本研究中，我们发现NSUN2在骨肉瘤组织和细胞中高表达。我们还发现NSUN2表达越高，OS患者预后越差。我们的研究表明NSUN2可以促进OS细胞的进展。通过RNA测序、RIP、甲基化RIP筛选验证NSUN2的候选靶点，确定FABP5为靶点。我们观察到NSUN2通过诱导m5C修饰稳定FABP5 mRNA，并进一步促进OS细胞的脂肪酸代谢。此外，下调FABP5表达和添加脂肪酸氧化抑制剂均能抵消NSUN2对OS进展的促进作用。我们的研究证实NSUN2可以通过m5C提高FABP5 mRNA的稳定性，上调FABP5的表达，从而促进骨肉瘤细胞的脂肪酸代谢，最终起到促进骨肉瘤进展的作用。我们的研究结果表明，NSUN2是骨肉瘤患者有希望的预后标志物，并可能作为骨肉瘤治疗的潜在治疗靶点。本文于2023年2月发表于Cell Death and Disease（IF=9.685）上。

技术路线

结果

1）NSUN2在骨肉瘤细胞和组织中高表达

为了评估NSUN2在人类OS中的表达谱，我们分析了GEO数据库中的数据，发现NSUN2在OS组织中高表达(图1A,1B)。然后，我们分析来自UCSCXENA的TARGET-OS中的转录组数据和相应的生存信息，发现NSUN2表达越高，OS患者预后越差(图1C)。此外，我们采用逆转录qPCR (RT-qPCR)、免疫组化(IHC)和免疫印迹(western blot)方法检测了正常和骨肉瘤肿瘤组织中NSUN2的表达。RT-qPCR(图1D)、IHC(图1E)和western blot(图1F)结果显示NSUN2在OS组织中表达较高。根据NSUN2 IHC评分，23个肿瘤组织被鉴定为“高”(47.92%)，22个肿瘤组织被鉴定为“中”(45.83%)，3个肿瘤组织被鉴定为“低”(6.25%)；5个正常组织鉴定为“高”(10.41%)，11个正常组织鉴定为“中”(22.92%)，32个正常组织鉴定为“低”(66.67%)。这些结果的统计图如图1E所示。此外，NSUN2在骨肉瘤细胞系(143b, MG63, U2)中的表达也高于骨间充质干细胞(BMSCs)和人成骨细胞(hbb1.19)(图1G, H)。综上所述，所有这些结果提示NSUN2在OS中上调，且NSUN2高表达与不良预后相关。

2）NSUN2缺乏显著抑制体外骨肉瘤的进展

为了阐明NSUN2在OS进展中的功能作用，我们选择143b和U2细胞系进行进一步研究。我们使用shNSUN2#1和sh-NSUN2#2生成稳定的NSUN2敲除OS细胞系，然后检测这些细胞的增殖、侵袭和迁移能力。RT-qPCR和western blot结果显示，sh-NSUN2#1和sh-NSUN2#2显著降低了143b细胞(图2A、B)和U2细胞(图2C、D)中NSUN2的表达。CCK-8和集落形成实验表明，NSUN2缺乏降低了143b细胞和U2细胞的增殖能力(图2E-G)。为了检测骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力，我们进行了伤口愈合和transwell实验。结果证实敲除NSUN2后，143b和U2细胞的侵袭能力(图2H)和迁移能力(图2I)下降。总的来说，这些结果表明，在体外敲除NSUN2表达对骨肉瘤的进展有负面影响。

3）NSUN2缺乏可抑制OS细胞在体内的增殖

我们用稳定转染sh-NSUN2#1或sh-ctrl的143b细胞和U2细胞在裸鼠中生成肿瘤异种移植。我们将稳定转染的OS细胞接种于裸鼠左胫骨上段，观察肿瘤大小3周。接下来，我们牺牲所有裸鼠，并收集左腿进行微计算机断层扫描(micro-CT)。此外，我们收集并称重所有肿瘤。正如预期的那样，sh-NSUN2#1组肿瘤的最终大小小于sh-ctrl组(图3A-D)。此外，微CT扫描的结果显示sh-NSUN2#1组左腿骨破坏较轻，肿瘤体积较小(图3E, G)。此外，sh-NSUN2#1组肿瘤重量较轻(图3F、H)。IHC结果证实NUSN2和Ki- 67的表达在sh-NSUN2 # 1组肿瘤中降低(图31)。上述结果表明，NSUN2缺乏抑制OS细胞体内的增殖。

4）FABP5是NSUN2的潜在靶点

为了确定OS细胞中NSUN2的下游靶点，我们对稳定转染shNSUN2#1或OE-NSUN2的143b细胞进行RNA-seq。我们重点研究了与NSUN2表达水平呈正相关或负相关的基因(图4A)，并制作了包含所有这些基因的两张热图(图4B)。从热图中，我们得出结论，FABP5在“shNSUN2 VS sh-ctrl”和“OE-NSUN2 VS OE ctrl”中表达变化最显著。因此，我们推测FABP5是NSUN2在骨肉瘤细胞中的潜在靶点，且NSUN2通过调控FABP5的表达促进骨肉瘤的进展。为了验证我们的假设，我们在稳定转染的143b和U2细胞中，用RT-qPCR检测了FABP5 mRNA的表达水平，发现敲低NSUN2时，FABP5 mRNA的表达水平明显下降(图4C, F)，过表达NSUN2时，FABP5 mRNA的表达水平升高(图4D, G)。western blot结果也证实，敲低NSUN2时FABP5蛋白表达水平下降，过表达NSUN2时FABP5蛋白表达水平升高(图4E, H)。为了确定NSUN2是否通过直接或间接作用影响FABP5的表达，我们采用RIP法检测NSUN2蛋白是否能与FABP5 mRNA结合。结果显示，我们从143b和U2细胞中分离出的RNA中含有FABP5 mRNA(图4I, J)，说明NSUN2蛋白可以直接与FABP5 mRNA结合。以上结果表明，NSUN2蛋白可以直接靶向FABP5 mRNA，影响FABP5的表达水平。为了进一步验证我们的猜想，我们用RT-qPCR检测了我们采集的骨肉瘤组织和正常组织中FABP5 mRNA的表达，结果证实FABP5在骨肉瘤组织中也是高表达的(图4K)。这一结果进一步支持了我们的猜想，FABP5是NSUN2在骨肉瘤细胞中的潜在靶点。

5）NSUN2通过m5C促进FABP5 mRNA的稳定性

为了进一步验证NSUN2是否通过m5C调控FABP5的表达，我们构建了一个具有突变位点的NSUN2过表达质粒。前期研究证明NSUN2主要依靠C271和C321位点的两个半胱氨酸发挥甲基转移酶的作用。C321位点的半胱氨酸与胞嘧啶嘧啶环形成共价键，催化胞嘧啶甲基化，而C271位点的半胱氨酸介导甲基化RNA的释放。因此，我们在NSUN2的C271位点将“TG”突变为“GC”，使原序列“TGC”突变为“GCC”。通过这种方法，我们在NSUN2的C271位点将半胱氨酸突变为丙氨酸。采用同样的方法，我们还在NSUN2的C321位点将半胱氨酸突变为丙氨酸(图5A)，然后将突变的NSUN2质粒转染到143b和U2细胞中，用点印迹法检测所有稳定转染的细胞的m5C水平。我们发现sh-NSUN2导致m5C水平降低，而过表达NSUN2导致m5C水平升高(图5B)。然而，转移到突变NSUN2质粒的细胞m5C水平没有任何变化(图5B)。为了确认NSUN2是否可以调节FABP5 mRNA的m5C水平，我们对稳定转染的143b和U2细胞进行了甲基化RIP实验。m5C甲基化-RIP的结果显示，过表达NSUN2可以促进143b和U2细胞FABP5 mRNA的m5C水平，而突变NSUN2则不能。环亮氨酸可降低143b和U2细胞FABP5 mRNA的m5C水平，并呈浓度依赖性(图5C, D)。然后，我们用RT-qPCR检测143b和U2细胞中NSUN2和FABP5的表达。结果证实MUT-NSUN2可以促进NSUN2的表达，但不能促进FABP5的表达。环亮氨酸可以降低FABP5的表达，而不降低NSUN2的表达(图5E, F)。综上所述，m5C水平越高，FABP5 mRNA的表达也越高。接下来，我们研究NSUN2介导的m5C如何调控FABP5 mRNA的表达。我们检测放线菌素D (ActD, 5µg/ml)处理的143b和U2细胞中FABP5 mRNA的稳定性。结果表明，FABP5 mRNA的m5C水平越高，衰减到50%所需的时间越长，稳定性越好。也就是说，NSUN2可以通过m5C促进OS细胞中FABP5 mRNA的稳定性。此外，我们通过western blot检测143b和U2细胞中FABP5蛋白的表达，发现FABP5 mRNA的m5C水平越高，FABP5蛋白的表达越高(图5I, J)。

6）NSUN2促进骨肉瘤细胞脂肪酸代谢

众所周知，FABP5在脂肪酸代谢中起着非常重要的作用。为了评估NSUN2是否能促进OS细胞的脂肪酸代谢，我们首先用BODIPY 493/503检测稳定转染的143b和U2细胞的中性脂质水平。结果表明，NSUN2过表达导致骨肉瘤细胞中性脂质的收缩。与NSUN2类似，FABP5过表达也会导致中性脂质减少，敲除可增加骨肉瘤细胞中中性脂质的积累。此外，MUT-NSUN2未能改变OS细胞中中性脂质的含量，而依托莫司则增加了OS细胞中中性脂质的含量。与NSUN2过表达相比，环亮氨酸可通过降低FABP5 mRNA的m5C水平来降低FABP5的表达，从而影响OS细胞中中性脂质含量(图6A-D)。此外，我们还检测了游离脂肪酸(FFAs)和甘油的含量，以评估OS细胞的脂解活性。结果表明，OE-NSUN2和OE-FABP5均能促进骨肉瘤细胞中FFAs和甘油的水平。正如预期的那样，MUT-NSUN2未能改变OS细胞中FFAs和甘油的含量，而依托莫司则降低了OS细胞中FFAs和甘油的含量(图6E-H)。综上所述，NSUN2通过上调FABP5在OS细胞中的表达，促进中性脂质的脂解。

7）脂肪酸氧化抑制剂和FABP5缺乏均可抵消NSUN2对OS进展的积极作用

为了进一步证实NSUN2是否通过促进FABP5的表达和脂肪酸代谢促进OS的进展，我们对143b细胞进行了功能挽救实验。我们首先检测了FABP5 mRNA(图7A)和蛋白质(图7B)的表达水平。CCK-8的结果表明(图7C)和菌落形成实验(图7D,G)， NSUN2过表达对143b细胞增殖有促进作用，但这种促进作用可被依托莫司或FABP5缺失所抵消。FABP5过表达对143b细胞增殖的促进作用与NSUN2过表达相似。此外，依莫莫司可降低143b细胞的增殖。在transwell和伤口愈合试验中也得到了类似的结果。NSUN2过表达对143b细胞的迁移和侵袭有积极影响，但这种积极影响被FABP5缺失或依托莫司抵消。FABP5过表达对143b细胞的迁移和侵袭也有积极影响，而依托莫司则有负面影响(图7E, F, H, I)。此外，我们利用动物模型进一步验证了NSUN2-FABP5轴在OS进展中的功能作用。IHC结果(图7I, J)证明过表达NSUN2可以提高Ki-67的表达，而sh-FABP5可以抵消这种促进作用。综上所述，证明NSUN2通过促进FABP5的表达和脂肪酸代谢来促进OS的进展，而这种促进作用可以通过FABP5缺失或脂肪酸氧化抑制剂依托莫司来抵消。

结论：

NSUN2通过m5C提高FABP5 mRNA的稳定性，上调FABP5的表达，从而促进骨肉瘤细胞的脂肪酸代谢，最终起到促进骨肉瘤进展的作用。

参考文献：

Yang M, Wei R, Zhang S, Hu S, Liang X, Yang Z, Zhang C, Zhang Y, Cai L, Xie Y. NSUN2 promotes osteosarcoma progression by enhancing the stability of FABP5 mRNA via m5C methylation. Cell Death Dis. 2023 Feb 15;14(2):125. doi: 10.1038/s41419-023-05646-x.