看过来！涉及铁死亡和脂质过氧化的11分文章

铁死亡是一种铁依赖的细胞死亡，伴随着脂质过氧化的积累和抗氧化系统的功能障碍。谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）是肌萎缩侧索硬化症（ALS）的关键调节因子。然而，铁死亡在ALS中的作用机制尚不清楚。本研究发现ALS中SPY1表达降低是由MDM2（核定位的E3泛素连接酶）介导的泛素化降解导致的。此外，SPY1通过缓解GCH1 / BH4轴（铁死亡的一个电阻轴）失调和转铁受体蛋白1（TFR1）诱导的铁产生的脂质过氧化。此外，神经元特异性过表达SPY1通过上述两条通路显著延缓ALS转基因小鼠的发病并延长生存期。这些结果表明SPY1是铁死亡和ALS的新靶点。本研究于2023年1月发表于《Cell DeathDiffer》，IF：11.84。

技术路线：

主要研究结果：

1、原代大鼠神经元转录组数据揭示ALS、铁下垂和SPY1之间的关联

为初步筛选ASL（肌萎缩性脊髓侧索硬化症）相关机制和靶基因，GEO数据库中选取GSE7493进行分析。首先，对SOD1^G93A大鼠胚胎运动神经转录组数据进行标准化处理，减少个体偏差的影响。接下来，使用从FerrDb下载的铁死亡相关基因集，通过GSEA工具对所有16324个基因进行富集。ALS转录组数据在铁死亡中显著富集（图1B）。为鉴定靶基因，进行基因差异表达分析。共筛选出417个DEGs（DEGs）。其中，SPY1被证实在小鼠和细胞中下调（图1C）。随后，为鉴定SPY1（Speedy/RINGO细胞周期调节器家族成员A）参与ALS的潜在效应基因，对转录组数据进行分组，SPY1高、低表达组。筛选出215个上调基因和205个下调基因（图1D）。通过对比MU vsWT、SPY1高vs低和铁死亡相关的基因集，作者发现GTP环化水解酶GCH1是唯一与ALS、铁死亡和SPY1连锁的基因（图1E）。此外，David还从生物学过程、细胞组成和分子功能等方面对SPY1高、低序列中的DEGs进行功能标注表明GTPase活性也与SPY1表达相关（图1F）。最后，通过Pearson相关性分析确定SPY1和GCH1之间的直接正相关性（图1G）。这些生物信息学结果提示SPY1可能通过GCH1在ALS中发挥影响铁死亡的作用。

图1原代大鼠神经元转录组数据揭示ALS、铁下垂和SPY1之间的关联

2、铁死亡参与ALS细胞模型

为进一步验证铁死亡在ALS中存在，选择NSC34细胞作为MNs（运动神经元）体外培养的体外细胞系，验证生物信息学分析结果。通过稳定转染hSOD1^G93A成功建立ALS模型。为初步判断细胞死亡情况，采用CCK8发现2μM RSL3（抑制GPX4的铁死亡诱导剂）孵育NSC34细胞2 h后，DFO和Fer-1（经典的铁死亡抑制剂）可特异性调控NSC34细胞中的铁死亡，而Zvad（caspase凋亡抑制剂）和Nec-1（RIPK1的坏死性凋亡抑制剂）对NSC34细胞中的铁死亡无调控作用（图2A）。Zvad和Nec-1对H2O2诱导的细胞凋亡具有保护作用，而铁死亡抑制剂Fer-1没有作用（图2B）。然而，凋亡和铁死亡的抑制剂均能增强hSOD1^G93A细胞的活力（图2C）。此外，这两种抑制剂的组合显示出明显高于任何其他组合或任何单独试剂的活性（图2C）。这些结果表明细胞凋亡和铁死亡对ALS都有贡献。

为进行系统的研究，对铁死亡参与的铁积累、脂质过氧化和GSH（谷胱甘肽）消耗等典型特征进行测试。首先，通过C11-BODIPY荧光探针检测到hSOD1^G93A与WT相比发生明显的脂质过氧化，并且可以被铁死亡抑制剂所限制（图2D-E）。电镜照片显示，hSOD1^G93A引起的线粒体减少、膜密度增加和嵴破坏与铁死亡诱导的相同（图2F）。此外，Calcein AM试验证实LIP升高（图2G）。用试剂盒检测，与对照组相比，hSOD1^G93A也出现GSH的异常降低（图2H）。qRT-PCR和蛋白质免疫印迹杂交验证筛选的铁死亡DEGs和关键基因的表达情况。突变体导致ALOX15和GDF15（分别是铁死亡的一个驱动和一个标记）上调，GCH1和GPX4下调，FSP1未发生变化（图1C, 2I-K）。这些结果系统地证明铁死亡参与ALS及相关特征。

图2铁死亡参与ALS的细胞模型

3、MDM2在ALS中通过泛素化降解SPY1

为探究ALS中SPY1减少的原因，qRT-PCR和蛋白质免疫印迹杂交检测转录和翻译水平，发现mRNA比例下降不如蛋白明显（图3A-C）。在进一步的实验中，使用MG132（蛋白酶体抑制剂）而不是胃酶抑素A与E64D（PE，自噬-溶酶体抑制剂）共孵育可以上调SPY1的表达（图3D-E）。与预期一致，SPY1的泛素化水平在hSOD1^G93A中显著升高（图3F）。然而，免疫共沉淀（CoIP）检测到SPY1与SKP2或NEDD4的相互作用没有明显增加（图3G）。为寻找ALS中介导SPY1泛素化的真正蛋白，利用氨基酸序列通过UbiBrowser预测具有相应组合结构的E3连接酶，其中MDM2（核定位的E3泛素连接酶）获得最高的预测评分（图3H）。值得注意的是，转染MDM2后，SPY1及其泛素化水平均呈剂量依赖性增加，敲低实验中SPY1的降解受到抑制（图3I-K）。更令人兴奋的是，CoIP证实hSOD1^G93A中SPY1与MDM2的外源性和内源性相互作用比野生型增强（图3L）。此外，在NEDD4和SKP2不变的情况下，hSOD1^G93A中MDM2的表达显著增加（图3M-N）。这些结果阐明升高的MDM2介导SPY1的泛素化，而SPY1的泛素化主要导致ALS表达降低。

图3ALS中SPY1的减少是由MDM2介导的

4、ALS中SPY1过表达抑制铁死亡

为确定SPY1与铁死亡之间的关系，在hSOD1^G93A和NSC34细胞中分别构建了SPY1的过表达和敲低（图4A）。在NSC34细胞中验证过表达SPY1增强对RSL3诱导的铁死亡的抗性，同时也减少hSOD1^G93A细胞的死亡（图4B-C）。在hSOD1^G93A细胞中转染SPY1后，脂质过氧化和游离铁呈剂量依赖性减少（图4D-F）。尽管GSH增加，但与转染剂量无关（图4G）。过表达SPY1对线粒体功能的保护是通过降低线粒体脂质过氧化的荧光和缓解线粒体膜电位（MMP）的下降来实现的（图4H-I）。这些结果表明SPY1是ALS中铁死亡的有效抑制剂。此外，其对RSL3诱导和Erastin诱导的铁死亡的抵抗也发生在其他肿瘤细胞中（图4J-L）。上述结果表明ALS中SPY1过表达抑制铁死亡。

图4过表达的SPY1在ALS细胞模型中抵抗铁下垂

5、SPY1通过调控GCH1/BH4和TFR1抵制铁死亡

为进一步探究SPY1调控铁死亡的机制，首先在过表达SPY1和对照的细胞中筛选ALS中发生改变的关键基因的mRNA。在SPY1高vs低，上调的铁死亡抑制因子GCH1被推测负责抵抗铁死亡（图1D-G）。随后，通过过表达SPY1转染（图5A-B），证实GCH1的翻译水平呈剂量依赖性上调。GCH1是BH4合成的限速酶，过表达SPY1后BH4合成显著增加，敲低GCH1后BH4合成减少（图5C）。同样，敲低GCH1后，过表达SPY1引起的细胞活力和脂质氧化的变化被逆转（图5D-F）。然而，LIP与GCH1的表达无关（图5G）。虽然给予BH4和过表达GCH1保护了SPY1敲低细胞的大部分活力和脂质过氧化（图5H-I）。已知游离铁在产生脂质过氧化中起着重要的作用，DFO和BH4的结合是偶然的，并意外地显示出额外的改进（图5H-I）。

为寻求不依赖于GCH1 / BH4轴对活性铁的调控，在过表达SPY1的细胞中检测铁转运相关基因的转录水平。与对照相比，负责转运铁进入细胞的TFR1（转铁受体蛋白1）的mRNA增加，DMT1和FPN1不变，分别负责细胞内铁的释放和输出（图5J）。与mRNA一致，蛋白水平显示过表达SPY1降低hSOD1^G93A中异常升高的TFR1（图5K）。

为确定SPY1对铁死亡的抵抗是否通过调节P53介导，作者检测在SPY1-Flag细胞中过表达P53对细胞活力和相关蛋白的影响。研究发现，过表达P53引起的反向细胞死亡可以被凋亡抑制剂和铁死亡抑制剂挽救，尤其是DFO，暗示P53与游离铁的转运存在联系（图5L）。并且随着p53的过表达，TFR1而不是GCH1的表达上调（图5M）。在表达SP1（S59A）突变后，作者发现SPY1可以通过上调SPY1的磷酸化水平激活GCH1（图5N）。综上所述，SPY1对铁下垂的抑制主要是通过调节GCH1/BH4轴抑制脂质过氧化TFR1表达式。

图5SPY1通过调控GCH1/BH4和TFR1抑制铁死亡

6、SPY1通过抑制神经元铁下垂保护ALS小鼠模型

为证明SPY1过表达对体内ALS进展的影响，将神经元特异性表达的重组病毒注射到hSOD1^G93A小鼠的侧脑室（图6A）。进行性肌无力和肌萎缩是ALS的主要表现。为评估肌肉状态，在病程中监测转棒试验和体重。SPY1过表达的hSOD1^G93A小鼠运动能力的下降被延缓（图6B）。体重下降的发生也延迟了约2周（图6C）。肌无力程度和肌肉萎缩程度是影响ALS发病和生存的主导因素。与对照相比，过表达SPY1延缓了（128.90 ± 8.17 vs.120.40 ± 7.28 d）的发生，延长了（149.90 ± 12.72 vs.136.80 ± 7.98 d）的存活（图6D-E）。

接下来，对150 d的小鼠腓肠肌和腰髓组织进行组织化学染色，以阐明SPY1的保护机制。结果显示，SPY1显著延缓转棒实验对应的hSOD1^G93A小鼠神经源性萎缩（图6F）。作为MNs的特异性标志物，脊髓前角SMI32染色发现SPY1减少了MNs的丢失（图6F-G）。TFR1自身表达量的增加是铁积累的有力证据，在hSOD1^G93A中发现并被SPY1校正（图6F-H）。此外，脂质氧化标志物4-HNE的免疫组化结果显示，过表达SPY1的小鼠，其最初升高的脂质过氧化水平降低（图6F-I）。此外，SPY1维持了较为健康的线粒体形态（图6J）。通过免疫组化验证TFR1的表达，发现GCH1在hSOD1^G93A小鼠中表达下调，过表达SPY1后GCH1被激活（图6K-L）。这些在hSOD1^G93A小鼠中得到的结果与体外一致，强调SPY1通过抑制ALS中神经元铁死亡来延长存活。

图6SPY1在hSOD1^G93A小鼠中通过抵抗神经元铁死亡发挥保护作用。

结论：

作者通过对ALS中基因SPY1的功能富集，发现其具有转录正调控作用，也为SPY1通过磷酸化SP1调控GCH1的表达奠定基础。此外，抑制或敲低USP7增强p53的泛素化，伴随着p53水平的降低，导致TFR1的下调。作者的结果也表明SPY1通过抑制P53来调控TFR1。

参考文献：

Wang Y, Wang C. (2023). Quantitative reactive cysteinome profiling reveals a functional link between ferroptosis and proteasome-mediated degradation. Cell DeathDiffer. 30（1）:125-136. doi: 10.1038/s41418-022-01050-8.