环状RNA circTRPS1-2通过减少核糖体的产生抑制食管鳞状细胞癌的增殖和迁移

食管鳞状细胞癌（ESCC）是全球最常见的食管癌，在癌症中发病率排名第七，死亡率排名第六。全球超过一半的ESCC病例发生在中国。尽管ESCC的治疗策略取得较大进展，但其症状发作较晚且具有肿瘤异质性，这意味着大多数患者的预后较差。因此，了解疾病如何进展并确定可靠的预后标志物可能会改善ESCC的治疗和监测，从而改善预后。该研究发表在《Cell Death Discovery》，IF：7.109。

技术路线：

主要研究结果：

1. circTRPS1-2在ESCC组织中的表达

对三对匹配的ESCC和相邻正常组织进行高通量测序，确定了2685个在癌症中上调的circRNA和4881个下调的circRNA（图1a, b）。用fold change≥2和P＜0.05的临界标准，确定了5个上调的circRNA子集（hsa_circ_0006156、hsa_circ_0003764、hsa_circ_0000198、hsa_circ_0007324和hsa_circ_0016600）和41个下调circRNA的子集（图1c）。使用一组独立的30对ESCC和相邻正常组织，作者验证了5个上调的circRNA和以下10个下调最多的circRNA（图1d）：hsa_circ_0026782, hsa_circ_0085362（circTRPS1-2）， hsa_circ_0078299, hsa_circ_0000099, hsa_circ_0008967, hsa_circ_0001546, hsa_circ_0001882, hsa_circ_0001073, hsa_circ_0000638和hsa_circ_0000117。用引物检测的特异性较弱的circRNA被排除。最后，作者决定关注最失调的circRNA, circTRPS1-2，进行进一步研究。

图1通过ESCC组织高通量测序鉴定circTRPS1-2

2. circTRPS1-2在ESCC中的表达下调及亚细胞定位

根据UCSC基因组浏览器（GRCh37/hg19），CircTRPS1-2位于染色体8:116599227-116635985（图2a）。该基因由TRPS1基因的第2外显子到第5外显子反向剪接产生，长度为2821 bp（图2b）。作者发现，与HEECs相比，circTRPS1-2在K150和E109细胞系中均下调（图2c）。反向剪接通过qRT-PCR产物的Sanger测序进行验证（图2d）。发散引物可从cDNA而非基因组DNA扩增circTRPS1-2，而聚合引物可从cDNA和基因组DNA扩增线性TRPS1（图2e）。这些结果支持以下观点：circTRPS1-2是通过反向剪接而不是反式剪接或基因组重排产生。CircTRPS1-2的环状结构通过其对RNAse R消化的抗性得到了证实（图2f）。根据FISH（图2g）和核质分选（图2h），CircTRPS1-2主要定位于细胞质和细胞核。

图2circTRPS1-2在食管鳞状细胞癌组织中的表征和亚细胞定位

3. circTRPS1-2在ESCC中表达下调并与不良预后相关

在一组30例匹配的ESCC和相邻正常组织中，作者发现circTRPS1-2在肿瘤中显著下调（图3a）。在BaseScope检测中获得了类似的结果，环状RNA主要定位于细胞质和细胞核（图3b, c）。在30例患者中，circTRPS1-2表达低于中位水平的患者3年总生存率显著低于表达高于中位水平的患者（图3d）。circTRPS1-2可能作为肿瘤抑制因子对抗ESCC，其低表达预示不良预后。

图3circTRPS1-2在ESCC中表达下调，其表达与患者预后呈正相关

4. CircTRPS1-2抑制ESCC细胞的增殖和迁移

为了研究circTRPS1-2在ESCC细胞中的生物学功能，作者在两种ESCC细胞系中分别转染过表达circTRPS1-2的质粒和敲低circTRPS1-2的siRNA（图4a）。这些转染没有显著影响线性TRPS1的表达（图4b）。基于克隆形成实验（图4c, d），EdU掺入实验（图4e, f）和CCK-8实验（图4g)，过表达circTRPS1-2显著降低了ESCC细胞的活力和增殖能力。基于伤口愈合（图4h, i）和transwell迁移（图4j, k）的实验，它还显著降低了ESCC细胞的迁移能力。敲低circTRPS1-2具有相反的作用。

图4circTRPS1-2抑制ESCC细胞增殖和迁移

5. CircTRPS1-2抑制体内肿瘤的发生和转移

作者通过皮下或尾静脉给小鼠注射了已感染过表达circTRPS1-2或shRNA的重组慢病毒的K150细胞，以敲低circTRPS1-2。在皮下肿瘤实验中（图5a），过表达circTRPS1-2导致肿瘤体积（图5b）和重量（图5c）显著减小。而敲低circTRPS1-2则产生相反的作用。在肿瘤转移实验中，敲低circTRPS1-2显示出显著更多的浅表转移（图5d）、肺转移（图5e, f）和表面和深部的总体转移（图5g）。过表达circTRPS1-2显示更少的肺转移（图5f）和总转移（图5g）。

图5CircTRPS1-2在体内抑制ESCC的发生和转移

6. CircTRPS1-2可能调控核糖体的生物发生

为了阐明circTRPS1-2在ESCC中发挥肿瘤抑制作用的通路，作者在K150细胞中免疫沉淀RNA，并使用质谱鉴定了潜在的蛋白结合伴侣。在排除了由正义和反义RNA探针拉下的26个蛋白质后，作者分析了与正义探针特异性结合的15个蛋白质（图6a）。与之前的研究不同，作者在RNA pulldown实验中没有检测到Argonaute2，这表明microRNA海绵可能不是circTRPS1-2的主要功能机制。GO和KEGG富集分析表明，这15种蛋白与核糖体和核糖体RNA在核糖体和细胞质中的加工密切相关（图6b, c）。作者假设circTRPS1-2可能参与核糖体的生物发生，因此作者在15个候选相互作用子中检测了5种核糖体蛋白：S4X、S8、S24、L7和L11。作者使用RNA pulldown证实circTRPS1-2直接与这些蛋白质结合，随后使用蛋白质印迹法（图6d）；使用RNA免疫沉淀，随后进行qRT-PCR（图6e）；以及使用免疫荧光染色（图6f），将所有5种核糖体蛋白定位到细胞质和细胞核，类似于circTRPS1-2。接下来，作者用过表达或敲低circTRPS1-2的重组慢病毒感染K150细胞。根据260nm处的吸光度（图6g），过表达导致细胞提取物中核糖体水平较低，且降低到较高水平（图6g）。电镜观察显示，过表达导致核糖体数量和核仁减少，而敲低则相反（图6h）。

图6circTRPS1-2与核糖体蛋白的结合及其对核糖体生物发生的影响

结论：

该研究发现了一个新的circRNA，circTRPS1-2，可以通过减少核糖体的产生来抑制ESCC的增殖和迁移，并确立了它在ESCC治疗和预后预测中的潜在用途。

参考文献：

Zhao R, Chen P, Qu C, Liang J, Cheng Y, Sun Z, Tian H. Circular RNA circTRPS1-2 inhibits the proliferation and migration of esophageal squamous cell carcinoma by reducing the production of ribosomes. Cell Death Discov. 2023 Jan 12;9(1):5. doi: 10.1038/s41420-023-01300-9.