eIF4E重编程可变剪接
异常剪接通常归因于剪接因子（SF）突变，并与包括急性髓系白血病（AML）在内的恶性肿瘤有关。发现了一种与突变无关的方法，即真核转录起始因子eIF4E，也能广泛地重编程可变剪接（AS）。本文于2023年2月发表在《EMBO JOURNAL》期刊上。
技术路线：
主要实验结果：
1、eIF4E过表达通过其RNA输出功能影响剪接因子的蛋白水平
作为研究eIF4E在剪接中可能作用的第一步，作者检查了先前收集的内源性核eIF4E RIP-seq数据集，该数据集来自侵袭性B细胞淋巴瘤LY1细胞系，其中核eIF4E与约3000个转录本相关。作者分析显示，eIF4E与约100个RNA相关，这些RNA编码参与剪接调节的因子，其中53个RNA编码主要剪接体的组分，包括SF3B1和U2AF1，这些因子在AML中经常突变。有趣的是，STRING分析揭示所有主要的剪接复合体的显著富集，根据剪接组的不同，FDR范围从0.0016到2.19×10－49不等（图1A）。这个结果促使作者分析内源性eIF4E是否可以调节剪接因子的产生，从而调节剪接。
为探究潜在的eIF4E剪接轴，作者基于以下几个原因优先使用U2OS细胞进行研究。首先，与上述淋巴瘤细胞不同，U2OS细胞具有内源性eIF4E水平，这与健康的志愿者细胞相似，使作者能够测量eIF4E过表达的影响。其次，在细胞核中观察到内源性和过表达的eIF4E，这与剪接和细胞质中的潜在作用一致（图1B-H）。第三，eIF4E在这些细胞的capping、CPA、核RNA输出和翻译中发挥着公认的cap - dependent作用。最后，淋巴瘤和U2OS细胞之间这些相互作用的保守性表明这是eIF4E的一般功能，而不是淋巴瘤特有的现象。考虑到这些，作者生成了3个稳定的2FLAG-eIF4E过表达或vector对照细胞株。首先确定eIF4E是否调节SFs的水平。WB显示，在2FLAG-eIF4E细胞中，SF3B1、U2AF1、U2AF2、PRPF6、PRPF8、PRPF19、PRPF31、SNRNP200蛋白水平较Vector对照组升高约2 ~ 3倍（图1C）。CyclinD1和Mcl1作为阳性对照，而b-actin作为阴性对照，因为它们不是eIF4E的靶标（图1C）。与过表达相反，使用CRISPR-eIF4E或CRISPR-Ctrl U2OS细胞系检测结果显示内源性eIF4E敲低会降低这些SFs的水平（图1D）。这些发现表明内源性eIF4E影响剪接机制的产生，因此，eIF4E对SFs的影响并不局限于以eIF4E升高为特征的环境。总之，eIF4E依赖的方式可以驱动SFs的产生。eIF4E靶向的SFs存在于每个主要的剪接体复合体中（图1A和1E）。
接下来探究eIF4E是否通过核输出的机制影响SFs蛋白的产生。作者从核裂解物中进行eIF4ERIP以确定eIF4E是否与U2OS细胞中SFs编码的RNA结合。在IP过程中，核裂解物与甲醛交联以防止重配，并通过RT-qPCR监测RNA。观察到含有SF3B1，SNRNP200，PRPF6，PRPF8，PRPF31，U2AF1，U2AF2的内源性核eIF4ERIP相比于input，被富集了约2到4倍（图1F）。鉴于这种相互作用，作者研究了这些SFs编码RNA是否为eIF4E依赖核输出的靶标。为此，作者使用上述三种不同的细胞系，通过RT-qPCR检测2FLAG-eIF4E细胞中相对于Vector对照的细胞核和细胞质部分的RNA水平，发现它们都在eIF4E过表达后胞质/核比率增加了~2倍，表明eIF4E过表达增加了它们的核输出（图1G）。分级质控采用半定量PCR检测U6snRNA和tRNAMet，其分别表示细胞核和细胞质部分（图1G）。总之，这些发现表明，eIF4E增强SFs编码RNA核输出，这为eIF4E介导的SFs蛋白产生的升高提供了一种机制。
除了通过核RNA输出来驱动SFs的产生外，eIF4E还可能间接驱动转录和/或改变SFs编码RNA的转录稳定性，作为驱动其蛋白质产生的平行手段。然而，作者注意到文献中典型的eIF4E靶点，eIF4E过表达不调节任何RNA的总水平（图1H）。因此，eIF4E不影响这些SF编码转录本的稳态转录或RNA稳定性。
图1eIF4E通过其核运输活性改变SF景观
为分析eIF4E依赖的RNA输出与其翻译功能对SF蛋白产生的相对贡献，作者使用了一个功能分离突变体。eIF4ES53A突变体具有完全结构，结合m7Gcap，促进eIF4E依赖的翻译和野生型eIF4E；然而，它不能促进依赖eIF4E的核内RNA输出。作者比较了2FLAG-eIF4E、S53A突变体和Vector对照的SFs蛋白产量。检测了每个细胞系的3个稳定克隆，并注意到野生型和S53AeIF4E表达水平相似（图2A）。正如预期的那样，作为eIF4E-RNA输出的既定目标，如CCND1，S53A突变体不能刺激细胞cyclinD1蛋白的产生，其水平与Vector对照组相似，而在野生型eIF4E过表达的细胞中，其水平如预期的那样升高。总之，对于所测试的SFs，S53A突变体没有像野生型eIF4E那样促进蛋白表达，这证实了eIF4E在SFs蛋白升高中具有核输出作用。
为更深入地研究一些SFs在RNA输出和翻译水平上共同调控的可能性，作者使用多聚体装载来直接测量翻译效率，即每个转录本装载的核糖体数量（图2B）。如预期的，2FLAG-eIF4E和Vector细胞的整体多核糖体特征是不可区分的（图2B）。在较重的馏分中发现的转录本，每个转录本有更多的核糖体，因此比在较轻的馏分中发现的转录本翻译效率更高。用RT-qPCR比较了2FLAG-eIF4E和Vector U2OS细胞系中单体、轻质和重质多核糖体部分的SF编码RNA含量（图2B）。预计在翻译水平上受到影响的RNA在重核糖体部分会增加，同时在轻核糖体和单体部分会减少。发现ACTB mRNAs没有因为eIF4E的表达而发生改变，而阳性对照MYC和VEGF则如预期的那样转移到较重的核糖体中。PRP31、U2AF1、SNRNP200或PRPF6转录物的核糖体负荷没有变化。然而，PRPF8、SF3B1和U2AF2 mRNAs的特点是eIF4E依赖性地转移到重多核糖体，并在轻核糖体和单体部分减少（图2B，中间部分）。与S53A突变体观察到的蛋白水平一致，观察到这里的大多数eIF4E目标是核输出目标；然而，少数目标在输出和翻译水平上都对eIF4E敏感，使得它们对eIF4E水平更加敏感。
综上所述，eIF4E与许多SF编码RNA相互作用并促进其核出口。此外，eIF4E并没有调节这些转录物的稳态转录或稳定性。对S53A突变体的研究强烈支持eIF4E的核RNA输出功能在驱动SF蛋白生产中的主要作用，但对一些SFs来说，也有翻译的贡献，使这些后一种RNA对eIF4E失调更加敏感。
图2分析S53AeIF4E突变体对其改变SF景观能力的影响及其在翻译中的作用
2、eIF4E在AML细胞系和原发性AML标本中驱动SFs的产生
为从遗传学角度剖析eIF4E在AML背景下的作用，并与U2OS进行比较，以确定这些eIF4E机制是否在不同的细胞类型中是保守的，构建了eIF4E或Vector NOMO-1稳定细胞系。NOMO-1 eIF4E细胞产生的eIF4E蛋白水平和定位与高eIF4E AML标本相似（图3A）。相比于对照组，这些SFs蛋白水平在NOMO-1 eIF4E细胞中上调（图3A）。而使用eIF4E inhibitor ribavirin的效果则相反（图3B）。因此，eIF4E对SFs的调控也适用于AML细胞。
接下来，研究原发性AML标本中eIF4E状态是否与SFs水平相关。如图3C所示，结果和AML细胞类似，相比于健康或正常组，eIF4E高表达的AML患者组SFs蛋白水平显著升高（图3C）。因此，这些SF的升高并不是AML患者标本的普遍特征，而是与eIF4E水平相关，这与在U2OS和NOMO-1细胞中的研究一致。
图3eIF4E在AML中重编程SF景观
随后检测eIF4E是否与SFs相互作用，为eIF4E可能影响剪接的提供额外手段。在RIPs之前，核裂解物用甲醛交联，以防止处理过程中的重新组合。观察到内源性eIF4E与U1、U2、U4、U5和U6snRNAs免疫共沉淀，相比于input，在U2OS细胞（图1F）以及NOMO-1细胞（图3D）的核裂解物中富集了约3至10倍。内源性eIF4E与阴性对照（GAPDH和ACTB）无关。此外，在U2OS或NOMO-1细胞中eIF4E过表达后，UsnRNAs的水平没有改变，这表明eIF4E没有导致更多剪接体的产生（图1H和3E）。鉴于UsnRNAs在剪接体中发挥结构和催化作用，作者研究了eIF4E是否与剪接体的蛋白质组分物理相关，结果发现内源性eIF4E与U2OS（图4A）和NOMO-1细胞（图4B）中每个主要剪接体复合体的蛋白组分发生免疫沉淀，但不沉淀阴性对照。因此，正如在eIF4E依赖capping和CPA中观察到的那样，eIF4E促进SFs的产生可能是为了增加其与它们的蛋白质形式物理相互作用的能力。总之，eIF4E与几个主要剪接体的SF和UsnRNAs结合，并在AML和U2OS细胞环境中提高了SF蛋白水平。因此，eIF4E被定位为在不同的细胞环境中调节剪接，这表明这可能是eIF4E的一个广泛适用的特性。
4、eIF4E与剪接体的相互作用是RNA和m7Gcap敏感的
如上文所述进行免疫沉淀，只是由于RNAse步骤，U2OS细胞的核裂解物没有甲醛交联，然而，即使在没有交联的情况下，在未处理的对照组中，SFs和eIF4E之间也观察到相同的相互作用（图4A vs 4C）。观察到SF3B1，U2AF1，U2AF2，PRPF6和PRPF8都存在于未处理的对照中，并且这种相互作用在RNAse处理后减少了约5倍（图4C）。分离对照表明，作为核标志物的Lamin在这些核裂解物中富集，而MEK1作为细胞质标志物缺乏，此外，在处理或未处理的样本中，eIF4E均未与Lamin免疫沉淀（图4C）。因此，eIF4E-SF相互作用需要完整的RNA。
考虑到RNAse处理同时针对底物m7Gcap的pre-mRNAs和UsnRNAs，作者研究了用m7Gcap的类似物处理的影响，这将破坏m7Gcap的mRNA相互作用而不影响UsnRNA介导的相互作用。进行eIF4ERIPs作为m7GpppG或阴性GpppG对照的功能，并通过WB监测SF的关联（图4D）。关于RNAse处理，核裂解物没有甲醛交联，eIF4E在m7GpppG或GpppG处理的样品中都能免疫沉淀自身（图4D）。此外，eIF4E-4EBP1的相互作用没有受到m7GpppG或GpppG的影响，eIF4E-IP与阴性对照H2B也没有影响。相对于GpppG对照组，eIF4E与PRPF6、U2AF3和SF3B1之间的相互作用被m7GpppG处理减少了2-5倍（图4D）；此外，HuR/ ELAVL1-eIF4E复合物在m7GpppG处理下也减少了约5倍（图4D）。鉴于eIF4E通过m7Gcap相互作用与大多数RNA相关，这些研究表明，eIF4E和SF的相互作用是由底物m7GcapRNA介导和/或稳定的。这些结果表明，eIF4E招募了选定的m7Gcap的RNA到剪接体，并且/或者在那里稳定了它们的相互作用。
图4eIF4E以RNA和帽依赖的方式与剪接机制发生物理相互作用
5、单独过表达eIF4E足以改变剪接程序
基于上述发现，作者监测了eIF4E对U2OS细胞整体水平剪接的影响。使用rMATS，观察到约760个转录物的约890个剪接事件被改变（FDR-adjusted P-value < 0.15; inclusion differences of > 0.05 or < 0.05），使用更严格的截断值（Pvalue< 0.1, inclusion level differences of > 0.1 or < 0.1），观察到493个转录物的555个剪接事件（图5B）。在RNA-Seq实验中，共检测到TPM大于10的5738个被注释的转录物，表明约15%的被注释的转录物是以eIF4E-dependent的方式进行差异剪接的。SE是最频繁的事件（约55%），其次是MXE事件（约30%）（图5A）。聚类热图显示所有类型的剪接事件仅基于eIF4E水平被分离（图5B）。GO分析显示，这些转录本参与的GO条目包括细胞周期、膜运输、DNA修复和微管细胞骨架组织。PPI富集分析与GO一致，排名靠前的是细胞周期，RNA代谢和膜运输（图5C）。这些结果表明单独过表达导致AS景观改变。
6、在AML中eIF4E水平与差异剪接程序相关
接下来研究了eIF4E依赖性剪接在AML中的相关性，因为在AML中用利ribavirin靶向eIF4E提供了临床益处，包括在早期临床试验中AML患者中的一部分得到缓解。第一步，作者分析了来自437份AML患者样本和17份来源于人脐带血的正常CD34+细胞样本的RNA-Seq数据（图6A-C）。通过RNA-Seq数据对样本进行了预筛选，以确保样本不携带AML中报告的主要突变，即U2AF1、SRSF2或SF3B1的突变，使用正常CD34+细胞作为eIF4E水平基准，将AML标本分为高eIF4E组和正常eIF4E组（图6A-B）。在rMATS分析中，选择10个eIF4E水平最高的AML标本和11个eIF4E水平正常的标本，即与正常CD34+细胞中的水平重叠或低于其水平（图6A-C）。相应的临床数据显示，与11名eIF4E水平最低的AML患者（1396天，图6C）相比，10名高eIF4E的AML患者的总生存期急剧下降（中位生存期136天，图6C）。用rMATS比较这些高eIF4E和正常eIF4E标本的剪接谱，观察到~1,600个差异剪接事件，影响到~1,500个RNA（FDR-adjusted Pvalue< 0.1, absolute value of inclusion level differences of > 0.1），如果降低阈值（(absolute inclusion value difference of > 0.05 and FDR-adjusted Pvalue< 0.15），则有~12,000个差异剪接事件影响~4,600个转录物（图6D）。对这些AS事件进行无监督聚类分析，发现AML患者eIF4E表达状态与MXE事件密切相关，在监测MXE事件时，20/21例AML标本的eIF4E水平是聚集的基础（图6E）。与U2OS细胞相似，观察到eIF4E依赖的MXE靶点的前GO富集项与U2OS数据集中的高度相似：细胞周期，DNA修复，膜运输和RNA代谢，PPI富集于有丝分裂中心体、膜运输和notch信号通路（图6F）。U2OS和AML数据集中所有eIF4E依赖的剪接靶点的交集获得了一组核心的约450个常见RNA靶点（图7A）。类似的，GO和PPI分析显示它们也富集到细胞周期，DNA修复，膜运输，染色质修饰，适应性免疫系统，MYC激活等（图7B）。
图6 AML中eIF4E依赖的AS事件
7、eIF4E AS靶向的一个子集与核eIF4E发生物理相互作用
作者使用RT–qPCR验证了图7A中核心拼接目标中的几个eIF4E诱导的可变剪接事件（图7C）。作者调查了eIF4E是否在剪接体之前（或与剪接体一起）被招募到pre-mRNA上？或者这些eIF4E-转录物的联系是否是剪接产物特异性的。为解决这个问题，使用甲醛交联进行核eIF4ERIPs并使用特异性引物RT-qPCR分析RNA含量。结果与用底物和产物RNA的引物获得的RNA的水平进行了比较，后者作为正常化对照。观察到，eIF4ERIPs与尚未经历目标剪接事件（"未剪接"）的转录本，以及那些已经经历了剪接事件（"已剪接"）的IL1B、IL4R、IKBKB、FAAP20和MAPK8IP3富集（图7D）。这些发现表明eIF4E在至少某些剪接靶点的剪接中起直接作用。此外，这些研究首次表明eIF4E与pre-mRNA结合，这对eIF4E的功能具有重要意义。
图7识别和验证核心剪接网络以及与pre-mRNAs AS靶点的物理相互作用
总之，本研究证实，核eIF4E与SF编码的RNA有物理联系，并驱动它们的核输出，这些转录物的核输出增强反过来又增加了它们对翻译机器的可用性，并提高了SF蛋白的水平，并且eIF4E在整体水平重建了细胞SFs（图7E）。
参考文献：
Ghram M, Morris G, Culjkovic-Kraljacic B, Mars JC, Gendron P, Skrabanek L, Revuelta MV, Cerchietti L, Guzman ML, Borden KLB. The eukaryotic translation initiation factor eIF4E reprograms alternative splicing. EMBO J. 2023 Feb 27:e110496. doi: 10.15252/embj.2021110496. Epub ahead of print. PMID: 36843541.