多维单细胞蛋白和RNA分析 剖析胸腺上皮细胞的细胞和功能异质性
胸腺间质细胞网络提供了控制T细胞发育和选择的必要环境，并提供独特的分子信号。最近的单细胞RNA测序研究揭示了胸腺上皮细胞（TEC）之间存在先前未被充分认识的转录异质性。然而，只有极少数细胞标记物能够对TEC进行可比较的表型鉴定。在本研究中，我们利用大规模并行流式细胞术和机器学习将已知的TEC表型解构为新的亚群。利用CITE-seq技术，将这些表型与细胞的RNA谱进行关联，从而实现了对相应的TEC亚型的表型鉴定。这种方法允许表型鉴定围产期cTEC并确定其在皮质基质框架中的物理定位。此外，我们展示了围产期cTEC在响应发育中的胸腺细胞时比例的动态变化，并揭示了它们在阳性选择中的非凡效率。总的来说，我们的研究确定了一些标记物，使我们能够解析胸腺间质的复杂性，同时实现了TEC亚群的物理分离，并将特定功能归属于个体TEC亚型。
该研究于2023年7月发表在《Nature Communications》，IF：16.6。
技术路线
结论
1、跨胸腺基质细胞亚群的细胞表面表达图谱的建立
为了在表型水平上解析胸腺间质的异质性，我们试图确定可靠准确地识别TEC亚群的新的细胞表面标记物，这些亚群之前只通过细胞的基因表达谱进行定义。为此，我们使用大规模并行流式细胞术对260个单个细胞表面标记物进行染色，并采用Infinity Flow这种计算机机器学习算法进行分析。胸腺基质细胞从1周、4周和16周的小鼠中分离为单个细胞，然后进行物理富集，并随后用12个骨干标记物染色，这些标记物要么单独，要么组合在一起可可靠地识别出血细胞造血细胞（CD45），不同的上皮细胞（EpCAM1，Ly51，UEA1，MHCII，CD40，CD80，CD86，Sca1，AIRE，Podoplanin），内皮细胞（CD31）和一些间质细胞（Sca1，Ly51，Podoplanin）（图1a）。下一步，将细胞分成若干等分，并分别对260个探索性标记物进行染色。在样本获取后，使用Infinity Flow在单个细胞分辨率上预测每个探索性标记物的表达水平。所得到的表达预测基于记录的骨干标记物的非线性函数。单细胞分析流程Seurat进一步分析和可视化观察到的异质性和共表达模式。数据的分层聚类结果显示，从1周大的小鼠中获得的数据产生了7个簇，而来自较年长动物的数据产生了10个簇，通过统一的流形近似投影（UMAP）在二维平面上呈现。
在三个不同时间点的每个时间点，可以根据关键标记物的表达可靠地识别主要胸腺基质细胞类型、上皮细胞、成纤维细胞、周皮细胞和内皮细胞，包括识别 TEC 的 EpCAM1 (CD326)、标记成纤维细胞的 CD140a、Ly51 和CD146 挑出周皮细胞，CD31 染色内皮细胞。其他标记识别了这些细胞簇内的亚群。选定的 260 个探索性标记中还包含一些用于检测骨干表位的抗体特异性，这允许在探索性标记和相同主要标记之间进行直接比较，从而验证 Infinity Flow 算法的实用性。
初始表达分析不仅通过流式细胞术证实了胸腺基质细胞类型之间的异质性，而且还揭示了各个 TEC 亚群的相对代表性随时间的动态变化。在第二次分析中，我们专门关注 EpCAM1+ 细胞，并在 1 周龄非老年小鼠中公开了三个独立的 cTEC 亚群（由细胞的 Ly51 和 UEA1 差异表达定义），从而说明早期 cTEC 群体具有更大的异质性。寿命在 4 周龄及以上的小鼠中，具有低表面 MHCII 表达的 mTEC（称为 mTEClo）根据分析的表面标记的差异表达分为 4 个独立的亚簇（图 1b-d）。
图1 Infinity Flow分析揭示TEC异质性
2、通过差异细胞表面标志物表达鉴定 cTEC 异质性
我们接下来查看CD83、CD40、hvem(CD270)和Ly51的表达是否明确地对单个cTEC亚群进行了分类，因为它们在1周龄小鼠中发现的cTEC簇的强度分布不同(图2a)。CD40和hvem的表达仅限于指定为cTEC I的亚群(见下文)，而另外两个标记在所有cTEC亚群中都被检测到，但在cTEC I上有更强的信号(图2a)。
分析先前发表的TEC13的scRNA-seq数据集，在围产期cTEC中检测到CD83、CD40和Enpep(编码Ly51)的转录本，尽管在不同的水平上(图2b，c)。相反，编码HVEM的基因Tnfrsf14的转录本只在几个TEC中检测到，但在几个簇中检测到，因此未能明确识别围产期cTEC。这一发现突显了基因表达研究在识别与细胞RNA图谱匹配的表面标记方面的局限性。为了进一步评估cTEC I亚簇与scRNA-seq确定的TEC亚型的关系，我们用SingleR软件生成了一个相似性分数，它将单个细胞的RNA表达谱与计算出的cTEC I细胞表面表达模式联系起来。这一分析表明，cTEC I与围产期cTEC配对的相似性分数最高(图2D)。
然后，我们的目标是定义允许通过流式细胞术分离围产期cTEC的表面标志物。我们使用了1周龄小鼠的cTEC I簇中高表达的标记，同时排除了从4到16周龄动物分离的大多数成熟cTEC上检测到的标记(图1b-d；2a)，因为老年动物中的皮质上皮群只含有比例非常低的围产期cTEC。在cTEC群体中，我们发现了一组同时表达CD83和CD40但在出生后早期Sca1阴性的细胞亚群(图2e)。CD83+CD40+Sca1−上皮细胞的比例在整个生命过程中发生了实质性的变化，随着细胞的相对表达在器官发生过程中逐渐增加，在1周龄的小鼠中稳定在(4.6×104±1.4万个细胞)，随后下降，在8周龄的动物中表现出最低的表达(2.4×103±2.3x103个细胞；图2e，f)。
围产期cTEC与其他cTEC亚群(包括cTEC簇II和III)相比，Hvem、Ly51和MHCII的细胞表面水平较高，这使得在没有Sca1的情况下，这些细胞通过CD83和CD40的高表达得以鉴定。围产期cTEC也显示出较高的Foxn1启动子活性，如在报告小鼠中所证明的那样，GFP的表达受Foxn1基因座的转录控制(图2g)。
图2 围产期cTEC的表面表达谱
3、典型和簇状TEC的鉴定
对成年小鼠的Infinity Flow分析显示出4个明显的mTEClo簇。簇I和II在4周和16周的小鼠中观察到，并且对于大多数260个探索性标记物（图1b-d）显示出相似的表达谱，包括Sca1和CD146的共同表达（图3a，b）。为了将这两个表型定义的亚群与它们对应的转录组确定的TEC亚型相匹配，我们对单个TEC的RNA谱进行了检测，以确定Ly6a / Ly6e（编码Sca1）和Mcam（编码CD146）的表达情况。虽然Ly6a / Ly6e的转录本尤其在亚型TEC中被检测到，但Mcam特异性RNA仅在不同的TEC中以低水平检测到，但主要在亚型TEC中检测到（图3c）。这种亚型的转录特征特征是cTEC和mTEC的特征，正如传统表面标记物Ly51和UEA反应性所定义的表型一样，这些特征贡献于这种独特的TEC亚型。再次使用SingleR软件包，计算了4周和16周mTEClo I和II与亚型TEC之间的相似度得分最高（图3d）。mTEClo亚群包含共表达Sca1和CD146的细胞，而且这种表型的细胞随着出生后的年龄增长而增加（图3e，f）。尽管最初只在mTEClo中检测到，但这个亚群在4周以上的小鼠的cTEC区域中也越来越多地观察到（图3e，f）。
没有找到一组专门识别mTEClo簇III的独特的表面标记。然而，在没有Sca1和CD63阳性的情况下同时表达CD66a和CD117确定了mTEClo簇IV。这个簇只在成年小鼠中检测到(图4a)，尽管在1周龄动物的mTEClo簇II中也可以检测到定义的4个细胞表面标记。因此，1周龄小鼠的mTEClo II簇可能代表了在老年动物中形成单独簇mTEClo IV的上皮细胞。单细胞转录分析仅部分符合mTEClo簇的表型分析，因为在绝大多数TEC中确实可以检测到Ly6a/Ly6e和CD63特异的RNA(图3c和4b)，而这些细胞中大部分缺乏Ceacam1(编码CD66a)和Kit(编码CD117)的转录本(图4b)。相似性得分显示mTEClo簇IV与AIRE后和簇状mTEC之间的最佳匹配(图4c)。
接下来，我们试图定义属于mTEClo IV簇的细胞的表型特征，以允许通过流式细胞术进行物理分离。为此，我们在Sca1-CD63-mTEClo中鉴定了CD66a和CD117阳性的细胞亚群，从而反映了mTEClo簇IV(图4d)的特征。大部分Sca1-CD63-CD66a+CD117+mTEClo细胞(~70%)也表达丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Dclk1(图4e)，它是簇状mTEC的典型细胞内标志。虽然簇状mTEC标记L1CAM在我们手中的染色不成功，但Dclk1阴性和阳性部分都具有先前描述的CD104lo簇状mTEC表型。此外，簇状mTEC中Dclk1阴性细胞的存在得到了先前scRNA-seq结果的支持。我们还观察到，Sca1-CD63-CD66a+CD117+mTEClo中Dclk1的缺失与CD66a和CD117的表面表达降低相关，表明这些细胞尚未完全分化为簇状mTEC。相反，绝大多数Dclk1阳性的TEC在Sca1-CD63-CD66a+CD117+mTEClo中检测到。在没有转录因子Pou2f3Dclk1的情况下，Sca1-CD63-CD66a+CD117+mTEClo细胞没有表达(图4f，g)，从而证实它们是簇状胸腺上皮细胞。利用这些表型特征，我们注意到4周龄小鼠中簇状mTEC的存在以最高的比例和细胞密度随时间变化(图4H，I)。由于CD66a-CD117-细胞(“非簇状”)在相对较少的Sca1−CD63−mTEClo中占相当大的比例(在4周时约为40%)，我们试图通过Bulk RNA-seq进一步确定它们的身份。具体地说，我们调查了这些细胞是否具有簇状mTEC的转录特征。这一分析揭示了非簇状细胞和簇状细胞之间的主要转录差异。与簇状细胞相关的基因在细胞的CD66a+CD117+部分中得到富集，包括Dclk1、Il25、Ceacam1和Kit。同样，在先前的scRNA-seq实验中确定的定义簇状mTEC的top基因在这些簇状细胞中表达水平非常高，而它们的转录产物在非簇状细胞中不存在。将整个非簇状转录组与注释的TEC亚集的相关性证实了从被鉴定为簇状mTEC的细胞。由于CD66a-CD117-非簇状mTEC的基因表达谱与任何已知的mTEC亚群都不匹配，因此这些稀有细胞(约占总TEC的4%)可能代表mTEC亚群的混合。
簇状mTEC起源于曾经表达组织限制性抗原Csnb15的mTEC。我们利用CsnbCre::Rosa26LSL-YFP报告基因来测试Sca1-CD63-CD66a+CD117+mTEClo是否表达Csnb的前体。与先前的研究一致，我们鉴定了Sca1-CD63-CD66a+CD117+mTEClo mTEC的70-80%带有YFP标记，这表明它们代表真正的簇状mTEC。MTEClo细胞由尚未表达转录促进剂AIRE的髓质上皮细胞组成，或者属于一组已经从AIRE阳性的成熟mTEC分化而来的细胞。此前已证明簇状mTEC至少部分来源于AIRE阳性前体，并富含表面糖蛋白Tspan8的表达，Tspan8是AIRE增强的组织限制性抗原。因此，我们测试了Sca1-CD63-CD66a+CD117+mTEClo(即绒毛状)mTEC表达Tspan8阳性。多达60%的簇状mTEC表达Tspan8，进一步证实了它们的身份，并确定这些细胞含有AIRE后的mTEC。YFP和Tspan8仅在Sca1+CD146+mTEClo典型TEC的一小部分中联合表达，表明它们属于TEC发育阶段，尚未混杂表达组织特异性抗原。
图3 确定cTEC和mTEC中的典型TEC
图4 定义簇状mTEC的表面标记组合
4、CITE-seq验证新的TEC标记
接下来，我们使用CITE-seq同时测定了单个胸腺基质细胞表面蛋白和mRNA表达的丰度。这一方法也被用来明确地证明可以结合使用新描述的细胞表面标记识别特定的和先前定义的TEC亚型。从1周龄和16周龄小鼠胸腺中分离出CD45-Ter119-细胞，并用寡核苷酸偶联抗体染色，每个抗体都分别针对EpCAM1、MHCII、UEA1、CD80、CD86、CD40、CD83、HVEM、CD73、SCA1、CD63、CD117、CD200、CD54、CD49a、CD274、CD9、Ly6G/Ly6C、CD6G/Ly6C和CD31。进一步对标记的细胞进行单细胞测序同时估计抗体衍生标签(ADTs)的丰度。
细胞聚类分析鉴定出了12个簇，其中数据分别来自单细胞基因表达谱分析或ADT。所进行的细胞类型注释是基于免疫基因组计划（ImmGen）提供的基因表达谱，并验证了各个簇的内皮细胞、成纤维细胞、间质细胞和上皮细胞的身份。因此，所选择的表面标记物的组合足以识别各个间质细胞类型。
对仅对TEC进行基因表达谱分析的结果显示出8个独立的簇（A-H），而对ADT数据进行分析则识别出9个簇（1-9）（图5a，b）。将这两种方法进行比较发现几乎成对的关系（图5c）。观察到的少数异常情况包括D和E簇，它们代表了4和5簇的混合，以及G簇，由于簇间Ly6C / Ly6G的差异表达而分裂成7和8簇（图5d）。在CITE-seq分析中使用的有限数量的抗体鉴定出三个cTEC簇（定义为UEA1非反应性细胞：1对应于簇A [1/A]，2/B和3/C），三个mTEClo簇（MHCIIloCD80lo：4/D，5/E和9/H）和三个mTEChi亚群（MHCIIhiCD80hi：6/F，7/G和8）（图5d-f）。
接下来，我们将CITE-seq定义的TEC簇身份分配给我们之前分类的亚型。簇1/A和在较小程度上的2/B对应于围产期cTEC。簇2/B进一步与成熟cTEC相关，而簇3/C与成熟cTEC和亚型TEC相关（图5d，f）。簇4/D和5/E与亚型TEC相关，而簇6/F与成熟mTEC和增殖TEC最为相似。簇7/G和8/G与成熟mTEC显示出很高的相似性，而簇9/H与tuft-like mTEC相关。值得注意的是，无法检测到后Aire mTEC和神经（n）TEC的特征转录特征。此外，我们还分析了数据以确定最近描述的模拟mTEC亚群的基因转录特征。发现“tuft细胞”的转录本存在于簇9/H中，而类似microfold、enterocyte/hepatocyte和keratinocyte的TEC的mRNA特征则在成熟mTEC群体中的簇G/7-8中被检测到。无法鲁棒地鉴定出与神经内分泌、纤毛、离子细胞和肌肉细胞相关的基因在指定的TEC亚群中的表达。
特定TEC亚型随年龄的变化，1周龄小鼠的1/A和2/B簇更加丰富，而16周龄小鼠的3/C、4/D、5/E、7/G和9/H簇的比例增加(图5d)。在CITE-seq定义的簇中，第1/A簇中的Tec表达CD83、CD40和hvem蛋白最高，从而证实了该细胞为围产期cTEC。这些标志物在第2/B群中表达减少，在第3/C群中完全缺失，表明前者代表了围产期和成熟/典型间样cTEC之间的发育中间细胞状态(图5d，g)。此外，cTEC成熟的同时，Foxn1转录减少，CD73、CD49a和Sca1蛋白表达增加。
CD117、CD63和Sca1蛋白的差异表达(通过ADT测量)将9/H簇确定为簇样mTEC(CD117+CD63-Sca1-；见上文和图5d，h)，从而证实了用于识别这些细胞的流式细胞术定义和门控策略是准确和实用的(图4g-i)。在第9/H簇(图5h)中检测到Dclk1和Ceacam1转录本，并与管状mTEC亚型(图5g，f)具有很高的相似性，进一步证实了这一结论。
基于ADT的Sca1蛋白表达检测与cTEC(第3/C簇)和mTEClo亚群(第4+5/D+E簇；图5d，f，h)中具有典型TEC转录特征的细胞相匹配。因此，仅通过Sca1的表达就可以明确地识别出典型的TEC。由于识别典型TEC的转录签名分布在三个CITE-seq定义的簇(3/C、4/D和5/E；图5d，f)上，CD146表达的检测似乎进一步解卷TEC的异质性，因为Sca1+cTEC和Sca1+mTEClo的一部分CD146+染色呈阳性(图3e)。
基于ADT的表面标记文件确定了单个TEC亚型。然而，相应的基因表达谱本身不足以识别这些细胞，尤其是因为表面蛋白和RNA表达之间偶尔存在差异。因此，CITE-seq可以验证所选的、新颖的表面标记和所选的门控策略的实用性。他们共同鉴定了对应于特定转录定义的簇的四个TEC亚群和代表两个相关簇的混合的两个亚群，即UEA1-CD83+CD40+Sca1-围产期cTEC(簇1/A)，UEA1-CD83-CD40-Sca1-成熟cTEC(2/B)，UEA1-CD83-CD40-Sca1+互典型mTEC(3/C)，UEA1+MHCIIloCD80loSca1+典型mTEC(4+5/D+E)，UEA1+MHCIIhiCD80hi成熟mTEC(6+7+8/F+G)，以及UEA1+MIIloCD80loSca1-CD63-CD66a+117+CDt-like mTEC(9/H)。
图5 CITE-seq验证新的TEC标记
5、围产期cTEC表现出更强的阳性选择潜力
接下来，我们试图将围产期cTEC定位于胸腺基质结构内。由于围产期cTEC的Ly51丰度高于其他皮质上皮细胞群(图2g)，我们使用这种差异在胸腺组织切片上定位围产期cTEC(图6a)。免疫组织学中Ly51信号强度的定量检测发现，这些细胞靠近髓质，Ly51信号逐渐增加，但细胞角蛋白8(K8)从被膜下区域向内皮质并最终深入皮质呈不变的染色(图6a，b)。
新分配的表面标记使单个cTEC群体的体外分离和功能测试成为可能。因此，我们研究了围产期(CD83+CD40+Sca1−)和非围产期(CD83−CD40−)cTEC对阳性胸腺细胞选择的影响。我们将这些细胞在胸腺上皮细胞培养物(TECx)中与CD69-CD4+CD8+(即预选双阳性)胸腺细胞共同培养两天。然后分析胸腺细胞与阳性胸腺选择相关的表型特征，即TCR和CD5的上调(图6c)。与由其他皮质上皮细胞组成的聚集体相比，由围产期cTEC组成的TECx的胸腺细胞总数和CD5hiTCRβhi的胸腺细胞数量显著增加(图6d)。综上所述，这些结果确定了围产期cTEC与髓质并列，在选择阳性胸腺细胞方面特别有效。
围产期cTEC数量随年龄增长明显减少。因此，我们探索了这种变化是否与实施阳性胸腺细胞选择效率的变化平行。因此，我们监测和比较了4周龄和16周龄胸腺细胞的成熟情况，并根据TcRβ和CD69的表达对胸腺细胞的成熟程度进行了分类(即0期：TcRβ−CD69−→阶段1：TcRβ+CD69+/−→阶段2：TcRβ+CD69+→阶段3：TcRβ+CD69−)。在老年动物中，预选胸腺细胞(即阶段0)的比例增加，而具有选择后表型(阶段2和3)的细胞的相对丰度显著降低(图6e，f)。这些体内结果表明，老年小鼠积极选择胸腺细胞的能力受到了损害，这与围产期cTEC的可用性下降有关(图2e，f)。
图6 围产期cTEC显示阳性选择能力增强
6、胸腺细胞串扰诱导围产期cTEC成熟
最后，我们研究了胸腺交叉素是否能解释围产期cTEC比例随年龄降低和胸腺细胞出生后增长之间的负相关关系。因此，我们首先确定了RAG2缺陷(RAG2−/−)小鼠的围产期cTEC的比例，这些小鼠的胸腺发育不良继发于胸腺细胞在DN3a阶段的发育停滞。我们发现在这些小鼠中，围产期cTEC的比例很高，不受年龄的影响(图7a)。因此，胸腺细胞处于发育阶段直到β-临界