m6A修饰环状RNA驱动的正反馈回路促进结直肠癌肝转移

         结直肠癌（CRC）是最常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率分别居所有恶性肿瘤的第3位和第2位。肿瘤转移是结直肠癌患者死亡的主要原因。临床上约有45-60%的CRC患者存在肝转移，超过90%的肝转移灶在初诊时无法切除。未行手术治疗的结直肠癌肝转移患者的中位生存时间仅为6.9个月，5年生存率低于5%。因此，破译结直肠癌肝转移的机制，发现新的治疗靶点，预防和干预转移，提高患者生存率具有重要的临床意义。环状RNA（circRNA）是一类特殊的内源性RNA分子，具有共价闭合环状结构，由剪接体催化的反向剪接事件产生，一个基因位点可以产生一个或多个circRNA。高通量测序和计算机模拟方法已经确定circRNA高度保守，并以疾病、组织或细胞特异性模式广泛表达。circRNA越来越多地参与各种人类疾病的发生和发展，一些circRNA被确定为预测疾病进展和预后的生物标志物。有趣的是，最近的一些证据表明，circRNA可以被翻译成功能性肽。例如，circRNA编码的截短蛋白如E-Cad-254aa和ARHGAP35-1289aa已被报道分别在胶质瘤和肝细胞癌中发挥关键作用。由于circRNA的头尾形状，其编码蛋白质的方式不依赖帽，由内部核糖体进入位点（IRES）或N6-甲基腺苷（m6A）修饰驱动。m6A是真核生物RNA中最丰富的内部修饰，它是动态可逆的。到目前为止，只有少数隐藏在circRNA中的内源性小蛋白被表征，绝大多数的功能相关性还有待发现。该研究发表在《Molecular Cancer》，IF：37.3。

技术路线：

主要研究结果：

1. Circ-YAP与结直肠癌肝转移相关

         为了鉴定在结直肠癌肝转移中具有翻译活性的关键circRNA，研究者分析了circRNA微阵列和核糖体新生链复合体结合RNA测序数据。接下来，检测了circ-YAP在新鲜冷冻组织中的表达，结果显示，与正常组织相比，circ-YAP在CRC组织中轻度升高，而在肝转移病例中显著过表达（图1A）。同样，在高转移潜能的CRC细胞系中也观察到高circ-YAP（图1B）。序列分析显示，circ-YAP来源于YAP前体mRNA第2、7外显子的反剪接，成熟全长为842 bp（图1C）。在正常和CRC细胞中，Circ-YAP对RNAse R消化均有抗性（图1D），而其线性异构体则无抗性(图1E)。此外，Circ-YAP的半衰期超过24h（图1E）。qRT-PCR和FISH检测结果显示，circ-YAP主要定位在细胞质中（图1F）。为了进一步探索circ-YAP的临床相关性，研究者收集了石蜡包埋组织，采用ISH检测circ-YAP的表达。与预期一致，circ-YAP在结直肠癌肝转移组织中显著上调（图1G，H），曲线下面积（AUC）值为0.8433（图1I）。更重要的是，高circ-YAP患者的生存时间比低circ-YAP患者短（图1J）。综上所述，这些数据表明，circ-YAP是一个真正的circRNA，可能用作CRC肝转移的一个有前景的指标和预后标志物。

图1 circ-YAP在结直肠癌肝转移组织中的鉴定

2. 敲低circ-YAP可减轻结直肠癌肝转移负荷

         为了研究circ-YAP的生物学功能，研究者使用CRISPR/Cas13d技术沉默circ-YAP。如图2A所示，设计的3种gRNA均能有效敲低circ-YAP，但不影响YAP mRNA的表达。划痕实验和transwell实验显示，沉默circ-YAP显著抑制LoVo细胞的迁移（图2B，C）和侵袭（图2D，E）。接下来，研究者在circ-YAP低表达的CRC细胞中过表达circ-YAP（图2F），结果显示，circ-YAP过表达后细胞迁移和侵袭能力显著增强（图2G，H）。通过在NOD/SCID小鼠的肠壁内注射TC71 PDX细胞建立自发性结直肠癌肝转移PDX模型（图2I）。10周后，对照组50%的小鼠发生了肝转移，而circ-YAP沉默组只有6.7%的小鼠发生了肝转移（图2J，K）。综上所述，这些数据表明circ-YAP在CRC细胞侵袭性和肝转移中起着至关重要的作用。

图2 沉默circ-YAP可减轻结直肠癌肝转移负荷

3. Circ-YAP编码YAP蛋白异构体YAP-220aa

         通过序列比对，研究者发现circ-YAP包含一个潜在的跨越ORF连接位点，编码220-aa蛋白（图3A，B）。为了验证circ-YAP是可翻译的，研究者在circ-YAP过表达载体中添加Flag标签；其中，circ-YAP的连接位点被移动到ORF的终止密码子，Flag序列被一分为二，位于circ-YAP的两侧（图3C）。转染HEK293T细胞后，flag tag抗体检测到约26 kDa的条带（图3D）。考马斯亮蓝染色显示，过表达circ-YAP后，这一条带更加明显，随后，通过质谱分析验证了YAP-220aa的独特氨基酸序列（图3E）。接下来，研究者制备了特异性靶向YAP-220aa的兔多克隆抗体，并证实其能有效检测内源性YAP-220aa蛋白（图3F）。鉴于circRNA的翻译是由IRES或m6A修饰驱动的，研究者首先评估了IRES对circ-YAP的翻译活性。值得注意的是，在翻译起始位点的近端发现了一个高度保守的m6A位点“GGACA”（图3B）。腺嘌呤突变为胞嘧啶后（图3C），YAP-220aa蛋白几乎无法被抗flag抗体检测到（图3D），这意味着m6A对circ-YAP翻译至关重要。YAP-220aa主要定位于细胞质（图3G），并且在高转移CRC细胞中过表达（图3H）。同样，沉默METTL3显著降低了内源性YAP-220aa的表达（图3I），并且与低转移的CRC细胞相比，高转移的CRC细胞中circ-YAP的m6A富集更多（图3J）。功能上，过表达circ-YAP增强了HT29和SW480细胞的迁移和侵袭，这些作用被m6A突变阻断（图3K，L）。此外，实验肝转移模型显示，野生型circ-YAP增加了CRC细胞在体内的肝转移（图3M），而m6A突变型circ-YAP没有增加（图3M）。综上所述，这些发现表明circ-YAP的功能是通过翻译成一个新的YAP蛋白亚型，这是由m6A修饰介导的。

图3 Circ-YAP编码由m6A介导的YAP-220aa

4. 翻译circ-YAP需要m6A阅读器YTHDF3

         研究者想知道哪些m6A阅读蛋白参与了circ-YAP翻译过程。如图4A所示，敲低YTHDF3，而不是YTHDF1/2，显著阻断了由circ-YAP过表达引起的YAP-220aa水平升高（图4A）。为了进一步验证YTHDF3对circ-YAP翻译的影响，研究者利用CRISPR/Cas9技术构建了YTHDF3敲除的CRC细胞株。结果表明，在YTHDF3−/−LoVo和SW620细胞中无法检测到p-circ-YAP-Flag的翻译产物（图4B，C）。相反，YTHDF3过表达细胞中YAP-220aa的表达显著增加，但这种作用在删除活性YTH结构域后消失（图4D）。RIP和RNA pull-down实验结果揭示了circ-YAP和YTHDF3之间的相互作用（图4E，F）。此外，体外合成circ-YAP并与GST-tag YTHDF3蛋白孵育，结果显示circ-YAP直接结合YTHDF3（图4G）。考虑到YTHDF3介导的翻译调节需要非经典eIF4G2，研究者进行了Co-IP实验，并证实YTHDF3和eIF4G2在SW620和LoVo细胞中形成内源性复合体（图4H）。正如预期，沉默eIF4G2显著降低了YAP-220aa蛋白水平（图4I）。RNA pull-down实验结果表明，eIF4G2和eIF4A/B被circ-YAP富集，而这些相互作用被YTHDF3敲除消除（图4J，K），表明circ-YAP通过YTHDF3招募eIF4G2翻译起始复合物。功能上，敲除YTHDF3或沉默eIF4G2后，circ-YAP引起的细胞侵袭增强被明显抵消（图4L，M）。

图4 YTHDF3招募eIF4G2复合体来驱动circ-YAP翻译

5. YAP-220aa与LATS1相互作用并增加YAP的核转位

         通过分析YAP-220aa蛋白序列，研究者发现YAP-220aa包含了YAP的WW1/2结构域，这是与LATS1相互作用所必需的，随后YAP被14-3-3磷酸化并被保留在细胞质中。因此，研究者推测YAP-220aa可能与LATS1竞争性结合，从而阻断YAP磷酸化。正如预期的那样，在转染p-circ-YAP-Flag载体的HEK293T细胞中，Flag-tag抗体大量免疫沉淀LATS1，然而，当WW1/2结构域被删除后，上述现象消失（图5A）。此外，在LoVo和SW620细胞中发现了YAP-220aa和LATS1之间的内源性结合（图5B，C）。敲低circ-YAP显著增加了YAP和LATS1, 14-3-3之间的相互作用（图5D，E）。此外，在circ-YAP沉默的CRC细胞中，YAP-220aa减少，而YAP磷酸化增加，然而，这些作用被野生型circ-YAP过表达消除，但没有被m6A突变的circ-YAP过表达消除（图5F，G）。增强circ-YAP的表达导致更多的YAP从细胞质进入细胞核，m6A突变后这种现象消失（图5H，I）。在circ-YAP沉默的CRC细胞中，YAP荧光素酶报告活性及其下游促转移基因水平显著降低（图5J，K）。YAP敲低或使用YAP的药物抑制剂维替泊芬治疗后，circ-YAP诱导的侵袭和肝转移结节被显著消除（图5L-N）。总之，这些数据表明，circ-YAP编码的YAP-220aa通过与LATS1相互作用激活YAP从而促进CRC的侵袭性和肝转移。

图5 YAP-220aa增加YAP活性

6. YAP/TEAD复合体反转录激活circ-YAP

         YAP是一种转录共激活因子，通过与一些转录因子结合来调节基因转录。有趣的是，YAP敲低或维替泊芬处理显著降低了HEK293T和CRC细胞中的circ-YAP表达（图6A）。值得注意的是，新生的circ-YAP也受到YAP和维替泊芬的影响（图6B），这表明YAP在转录水平调节circ-YAP表达。越来越多的证据表明，一些circRNA具有独立于其线性亲本的自身启动子。将circYAP的启动子片段插入pGL3-basic载体中，荧光素酶结果显示YAP在circ-YAP起始位点上游-974~-374处增加了circ-YAP的转录活性（图6C）。通过JASPAR工具进行序列分析，在上述区域发现了两个TEAD结合基序（TB1，-886~-877，TAAATACTAT；TB2，-406~-397，CATATTCTTT）（图6D）。如图6E、F所示，TB1或TB2的突变显著降低了circ-YAP的启动子活性，但当同时突变时，YAP-5SA引起的启动子活性增强被完全抵消。此外，YAP-5SA增加了TEAD2沉默细胞中circ-YAP的表达，但并未增加TEAD1/3/4沉默细胞中circ-YAP的表达（图6G，H），表明TEAD1/3/4负责yap介导的circ-YAP调控。此外，ChIP检测的结果表明，YAP与TB1和TB2结合（图6I），同时募集Pol II和随后的磷酸化（图6J，K），这是从起始复合物释放Pol II和起始延伸所需的修饰。此外，ChIP-re-ChIP数据表明，YAP/TEAD1复合物在circ-YAP启动子的TB1和TB2处富集（图6L，M），这也通过使用生物素标记的探针进行的DNA下拉实验进行了验证（图6N）。以上结果表明，circ-YAP被YAP转录激活，从而形成促进结直肠癌肝转移的正反馈环路。

图6 Circ-YAP是YAP激活的转录

7. circ-YAP/YAP-220aa/YAP调控轴的临床验证

         最后，研究者检测了YAP靶基因在结直肠癌组织中的表达。qRT-PCR结果显示，circ-YAP表达与促转移基因CYR61、CTGF、TWIST1和FOXM1呈正相关（图7A-D）。此外，免疫染色结果显示，92.5%的CRC病例具有相同的circ-YAP和YAP-220aa的表达趋势，只有7.5%的病例具有不一致的表达趋势（图7E，F）。并且高circ-YAP与YAP的核聚集呈强正相关（图7E，G）。YAP-220aa在有肝转移的CRC中表达高于无肝转移的CRC（图7H），其AUC值为0.8597（图7I），提示YAP-220aa可能作为预测CRC肝转移的指标。重要的是，高circ-YAP和yap-220aa的患者比低circ-YAP和yap-220aa的患者生存时间更短（图7J），表明两者联合比单独circ-YAP具有更好的预后价值。

图7 circ-YAP/YAP-220aa/YAP调控轴在临床样本中的验证

结论：

         综上所述，该研究揭示了circRNA编码的蛋白和Hippo/YAP信号通路之间迄今未被识别的偶联，对CRC肝转移的治疗具有指导意义。

实验方法：

         定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR），荧光原位杂交（FISH），原位杂交（ISH），免疫组织化学（IHC），细胞转染，伤口愈合实验，Transwell实验，CCK-8检测，小鼠结直肠癌肝转移模型的建立，蛋白质印迹，免疫共沉淀（Co-IP），免疫荧光（IF），RNA免疫沉淀（RIP），甲基化免疫沉淀（meRIP），RNA pull-down检测，荧光素酶报告基因检测，染色质免疫沉淀（ChIP），DNA pull-down检测

参考文献：

         Zeng K, Peng J, Xing Y, Zhang L, Zeng P, Li W, Zhang W, Pan Z, Zhou C, Lin J. A positive feedback circuit driven by m6A-modified circular RNA facilitates colorectal cancer liver metastasis. Mol Cancer. 2023 Dec 13;22(1):202. doi: 10.1186/s12943-023-01848-1.