RNA甲基化修饰（m6A）研究思路及方案设计
RNA甲基化修饰（m6A）研究思路及方案设计
RNA甲基化修饰约占所有RNA修饰的60%以上，而N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine, m6A）是高等生物mRNA和lncRNAs上最为普遍的修饰。目前发现microRNA，circRNA, rRNA, tRNA 和snoRNA上都有发生m6A修饰。 m6A修饰主要发生在RRACH序列中的腺嘌呤上，其功能由“编码器(Writer)”、“消码器(Eraser)”和“读码器(Reader)”决定[1]。“编码器(Writer)”即甲基转移酶，目前已知这个复合物的成分有METTL3，METTL14, WTAP和KIAA1429；而ALKBH5和FTO作为去甲基酶（消码器）可逆转甲基化；m6A由m6A结合蛋白识别，目前发现m6A结合蛋白（读码器）有YTH结构域蛋白（包括YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3， YTHDC1和YTHDC2）和核不均一蛋白HNRNP家族（HNRNPA2B1和 HNRNPC）。
m6A酶系统
METTL3是早先被鉴定为结合SAM的组件，其缺失引起小鼠胚胎干细胞、Hela细胞和HepG2 细胞中m6A peaks的减少。METTL3及其同源蛋白METTL14定位在富含剪切因子的细胞核内亚细胞器－核小斑（Nuclear speckle）上，显示ｍ６Ａ修饰可能和ＲＮＡ的剪切加工相关。WTAP与METTL3–METTL14 二聚体相互作用，并共定位于核小斑，影响甲基化效率，参与mRNA剪。而KIAA1429作为候选的甲基转移酶复合体的新亚基，是整体甲基化进程所必须的[2]。FTO是ALKB家族的成员，作为第一个被发现的去甲基酶，可影响剪切因子SRSF2的RNA结合能力，进而调控pre-mRNA的剪切加工过程[3]。目前已发现FTO调节异常与肥胖、大脑畸形和生长迟缓相关， 揭示m6A可能对这些疾病具有重要的调节功能[4-6]。ALKBH5是ALKB家族中被发现具有去甲基作用的另一个成员，以RNase A敏感的方式与核小斑共定位，它可直接催化m6A-甲基化腺苷去除甲基而不同于FTO的氧化去甲基化[7]. 此外，ALKBH5和它的去甲基化活性影响新生mRNA合的成和剪切效率[7]， 且ALKBH5敲除雄性小鼠表现出精子发生异常，这可能是精子发生相关基因表达改变的结果[7]。m6A mRNA修饰执行其功能主要通过两个途径： 精细调控甲基化转录本的结构，以阻止或诱使蛋白-RNA 相互作用；或被直接由 m6A 结合蛋白识别，诱发后续反应。目前一类含有YTH功能结构域的蛋白被鉴定为m6A修饰的结合蛋白。其中YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3， YTHDC1和YTHDC2己被证实是ｍ６Ａ的结合蛋白. YTHDF1主要影响ｍ６Ａ修饰基因的翻译，YTHDF2主要影响ｍ６Ａ修饰基因的降解，而YTHDC1结合ｍ６Ａ修饰的基因后影响其剪接。HNRNPC是一种丰富的核RNA结合蛋白，参与pre-mRNA的加工[8]，且研究表明HNRNPC通过m6A与 RNA结合调控目标转录本的丰度和选择性剪切[9].
图 1 m6A修饰的酶系统[10]
m6A生物学功能
越来越多的证据表明m6A修饰在哺乳动物中发挥重要的生物功能。例如，在转录后水平上调控RNA的稳定性[11]、定位[12]、运输、剪切[13]和翻译[14]。Claudio R. 等发现依赖METTL3的pri-miRNA甲基化，会促进DGCR8识别和加工，从而促进microRNA的成熟[15]。此外，m6A识别蛋白 HNRNPA2B1促进 pri-miRNA 加工成 pre-miRNA [16]。另外，环状RNA上m6A的修饰能促进环状RNA的翻译[17]。m6A修饰在基因表达调控中起着重要的作用，其调控机制的异常可能与人类疾病或癌症相关。目前发现m6A可能会影响精子发育（ALKBH5，METTL3，Ythdc2）、发育（METTL3、FTO、ALKBH5）、免疫（METTL3）、UV诱导的DNA损伤反应（METTL3，FTO）、肿瘤生成（YTHDF2）或转移（METTL14）、干细胞更新（METTL14）、脂肪分化（FTO）、生物节律、细胞发育分化、细胞分裂及其它的一些生命过程。例如，ALKBH5敲除的雄性小鼠增加了mRNA中的m(6)A修饰，其特点是凋亡影响减数分裂中期的精子细胞，引起生育能力受损[7]。METTL3和METTL14增加弱精症精子的m6A水平[18]， 在生殖细胞中，METTL3的敲除严重抑制精子分化和减数分裂的发生，转录组和m6A分析显示 精子发生相关基因的表达和选择性剪接发生了改变[19]。YTHDC2可促进靶基因的翻译效率，并降低其mRNA的丰度，在精子发生过程中起关键作用。当减数分裂开始时YTHDC2表达上调，YTHDC2敲除小鼠的生殖细胞没有经过偶线期的发育导致小鼠不育[20]。在DNA损伤反应中，METTL3可促进DNA聚合酶κ（Pol κ）与核酸剪切修复途径快速定位到UV引起的DNA损伤位点，当缺失METTL3时，细胞无法迅速修复UV照射引起的突变，并且对UV照射更加敏感[25]。在淋巴细胞性小鼠过继转移模型中， Mettl3缺陷通过影响mRNA m6A修饰，降低SOCS家族mRNA衰减，增加mRNA和蛋白表达水平，从而抑制IL-7介导的 STAT5活性和T细胞内稳态增殖和分化，进而抑制肠炎的发生[21]。在肝癌中，METTL14 通过调控pri-miRNA的m6A修饰，影响MiR-126的生成加工，从而抑制肝癌的转移[22]。在乳腺癌细胞中，低氧刺激能促进依赖低氧诱导因子HIF的ALKBH5的表达，而ALKBH5过表达降低了NANOG mRNA的m6A修饰，从而稳定mRNA提高NANOG的表达水平，最终增加乳腺癌干细胞所占的比例[23]。 此外， 低氧诱导乳腺癌细胞中依赖ZNF217的NANOG 和 KLF4 的mRNA m6A甲基化抑制，且ALKBH5敲除显著降低免疫缺陷小鼠乳腺癌的肺转移[24]。在肺癌中，METTL3能够促进肺腺癌细胞的生长、生存和侵袭，但还不清楚它是否作为 m6A 调节器或效应器发挥作用[25]。在急性髓细胞白血病（AML）患者中，m (6) A 调控基因的突变或拷贝数变化与TP53 突变存在密切联系，且m (6) A 调控基因的改变与AML不良预后相关[26]。此外，FTO在AML中高表达，它通过降低mRNA转录本中的m(6)水平，调节ASB2和RARA等靶点的表达，增强了白血病癌基因介导的细胞转化和白血病形成，并抑制全反式维甲酸(ATRA)诱导的AML细胞分化[27]。在脂肪形成过程中，FTO表达与m6A水平成负相关，促进脂肪形成[3]。在胶质细胞瘤样细胞中，ALKBH5 通过lncRNA FOXM1介导FOXM1基因pre-mRNA上的m6A修饰维持胶质瘤细胞的成瘤性[28]。此外，甲基转移酶METTL3或METTL14的敲除，能够改变m6A的富集和ADAM19的表达，极大地促进了胶质瘤细胞的生长、自我更新和肿瘤形成[29]。
图2 m6A RNA修饰和介导的功能[30]
m6A 的研究方向
（1） 主要是通过研究 m6A修饰相关的甲基化、去甲基化酶和识别蛋白的功能，进而研究m6A修饰的生物学功能和作用机制：一般通过敲除m6A酶分子，研究下游功能基因分子的表达和m6A甲基化情况，通过介导相关基因异常（可变剪切、稳定性、翻译、miRNA 调控）影响细胞表型和功能特征。
（2） m6A修饰图谱构建及作用机制：通过m6A甲基化测序（MeRIP-Seq, miCLIP）构建疾病细胞模型或者发病组织的 m6A 修饰谱，分析m6A的motif, peaks数量及分布，Peak 关联基因的特征，联合RNA-seq研究m6A甲基化与表达的关系。
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