HoxC5和miR-615-3p协同抑制hTERT的表达，从而抑制肿瘤发生
HoxC5和miR-615-3p协同抑制hTERT的表达，从而抑制肿瘤发生
在细胞分化过程中，端粒酶活性的抑制促进复制性衰老，同时作为包括人类在内的长寿性哺乳类生物肿瘤发生的生理障碍物。然而这其中的内部机制依旧不清楚。因此有研究人员对此进行了研究，并以“HoxC5 and miR-615-3p target newly evolved genomic regions to repress hTERT and inhibit tumorigenesis”为题，发表在Nature Communications（IF=12.124）上。作者研究了miR-615-3p是如何抑制hTERT的表达。miR-615-3p位于基因HOXC5的内含子区域。HOXC5属于高度保守的控制胚胎发生和发育的转录因子同源异型细胞框家族。出乎意料地是HOXC5通过阻断hTERT启动子和其末端增强子之间的相互作用抑制hTERT的表达。在长寿的灵长类生物中，hTERT的3’UTR区域和其上游的增强子区域是非常保守的。细胞分化过程中，miR-615-3p和hTERT被激活，并构成前馈环路协调hTERT的转录和转录后抑制。miR-615-3p和hTERT的表达异常可能有助于癌症发生过程中hTERT的激活。
研究路线：
研究结果：
图1 假定的miRNAs靶向hTERT 3’UTR区域的鉴定。a. RT-PCR检测不同细胞系中hTERT mRNA的表达量。人的胚胎干细胞中hTERT mRNA的表达量设为1。b. TRAP鉴定不同细胞系中端粒酶活性。c-e.与瞬时转染psiCHECK2空载体的细胞相比，瞬时转染psiCHECK2-5’UTR、psiCHECK2-3’UTR或psiCHECK2-5’+3’UTR载体的细胞中Renilla/Firefly荧光素酶相对荧光强度。f. 在稳定表达psiCHECK2-5’+3’UTR载体的海拉细胞中使用miRNA抑制剂文库，log2 Renilla/Firefly荧光素酶荧光强度比率的Z值分布图。Z值>2.7的选作候选基因进行进一步分析。g-i. 分别瞬时转染8个候选miRNA抑制剂的海拉细胞中Renilla/Firefly荧光素酶相对荧光强度、hTERT mRNA表达量和端粒酶活性。在干细胞和终端分化细胞中差异表达的miRNA标记为红色。
图2 在癌症细胞中miR-615-3p反向调节hTERT的表达。a.不同物种中miR-615-3p和TERT 3’UTR预测的结合位点示意图。b.在psiCHECK2-5’+3’UTR报告载体中miR-615-3p结合位点引入突变的示意图。c.在瞬时转染野生型或突变体psiCHECK2-5’+3’UTR报告载体的Hela和RKO细胞中Renilla/Firefly荧光素酶相对荧光强度。d、e.在瞬时转染对照发夹结构或miR-615-3p抑制剂的RKOHOP-92和RXF393细胞中，hTERT mRNA表达量和端粒酶活性。f、g.瞬时转染空载体或miR-615-3p的过表达载体的RPMI-8226、IGR-OV1和HCC-2998细胞中，hTERT mRNA的相对表达量和端粒酶活性。h.在2个独立的CRISPR/Cas9介导的miR-615-3p敲除的RKO细胞系中内源miR-615-3p的表达量。i-k.在miR-615-3p敲除的RKO细胞系中hTERT mRNA的相对表达量、端粒酶活性和端粒长度。
图3 HOXC5抑制hTERT的表达。a.miR-615-3p基因定位于HOXC5内含子区域的示意图。b、c.载有flag标签的过表达HOXC5 的慢病毒的Hela、PC-3、U251和BT549细胞中hTERT mRNA的相对表达量和端粒酶活性。d. 载有flag标签的过表达HOXC5 的慢病毒的Hela、PC-3、U251和BT549细胞中端粒酶长度。e.表达对照发夹结构或两个独立的干扰HOXC5的发夹结构的Hela细胞中内源hTERT mRNA的表达量。f. 表达对照发夹结构或两个独立的干扰HOXC5的发夹结构的Hela细胞中hTERT mRNA的相对表达量。g. 表达对照发夹结构或两个独立的干扰HOXC5的发夹结构的Hela细胞中端粒酶长度。
图4 人胚胎干细胞WA01中hTERT、miR-615-3p、HOXC5、PBX1-4和MEIS1-3的表达量。a. 人胚胎干细胞在单层培养中的神经分化过程。b.RT-PCR检测胚胎干细胞WA01神经分化过程中，多潜能基因（NANOG和OCT-4）和神经发育基因PAX6的表达量。胚胎干细胞WA01神经分化过程中，hTERT mRNA（c）、miR-615-3p（d）和HOXC5 mRNA（e）的表达量。f. WA01神经分化P0和P3阶段，PBX1-4和MEIS1-3的表达量。
图5 在Hela细胞中，HOXC5招募Pbx4和Meis3，抑制hTERT的表达。a.HOXC5功能区示意图。b、c. 载有flag标签的过表达GFP、WT或突变体（M1或M2）HOXC5的Hela细胞中hTERT mRNA相对表达量和端粒酶长度。d. Western blotting显示了Hela细胞中GFP、WT和突变体（M1或M2）HOXC5的表达量。e.在Hela细胞中，V5标签的HOXC5导致特异地Flag标签的Pbx4的免疫共沉淀反应；但对Flag标签的Pbx1、Pbx2或Pbx3没有影响。f. 在Hela细胞中，6xHis标签的HOXC5蛋白与体外翻译的、35S-蛋氨酸标记的Pbx4蛋白互作；但是对Pbx1、Pbx2或Pbx3没有反应。g. 在Hela细胞中，Flag标签的HOXC5导致V5标签的Meis3的免疫共沉淀反应；但对V5标签的Meis1或Meis3没有影响。h. 在Hela细胞中，瞬时转染共表达PBX4或MEIS3和HOXC5的质粒协同抑制hTERT mRNA的表达。
图6 HOXC5通过结合到hTERT上游增强子区域抑制hTERT的表达。a.ChIP-Seq显示HOXC5和PBX4在hTERT TSS上游-20kb区域结合；hTERT TSS区域富集有H3K27ac和H3K4me1，尤其是在端粒酶阳性的胚胎干细胞（WA01）癌症细胞（PC-3）中，但是在端粒酶阴性的初级纤维细胞（IMR90）中却没有。b. 过表达对照GFP或Flag标签的HOXC5的PC-3细胞中，RNA聚合酶Ⅱ、H3K4me1he H3K27ac的ChIP结果。c.过表达对照GFP或Flag标签的HOXC5的A375细胞中，RNA聚合酶Ⅱ、H3K4me1he H3K27ac的ChIP结果。d.WA01细胞中神经分化（P4）前后RNA聚合酶Ⅱ、H3K4me1he H3K27ac的ChIP结果。e.在A375细胞中共表达dCas9-KRAB和对照sgRNAs或sgRNAs靶向HOXC5在hTERT增强子上游-20kb结合区域的内源hTERT mRNA的表达量。f.在PC-3细胞中，与内源HOXC5结合位点相关的前10条生物学过程。
图7 HOXC5抑制hTERT的表达和肿瘤细胞的生长。在PC-3细胞中表达GFP、miR-615-3p、HOXC5或者同时表达miR-615-3p和HOXC5的体外克隆形成实验中的典型图像（a）和表达量（b）。肿瘤生长曲线（c）、肿瘤生长代表图像（d）和肿瘤重量（e）展示了NSG小鼠注射表达GFP、miR-615-3p、HOXC5或者同时表达miR-615-3p和HOXC5的PC-3细胞后肿瘤生长情况。散点图展示了THYM（胸腺瘤，上图）和TGCT（睾丸状干细胞瘤，下图）癌症样本中hTERT和HOXC5之间的斯皮尔曼相关性（f、i），miR-615-3p和hTERT之间的相关性（g、j）以及HOXC5和miR-615-3p之间的相关性（h、k）。
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