m6A RNA甲基化测序

m6A RNA甲基化测序
     RNA甲基化修饰约占所有RNA修饰的60%以上，而N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine, m6A）是高等生物mRNA和lncRNAs上最为普遍的修饰。目前发现microRNA，circRNA, lncRNA, rRNA, tRNA和snoRNA上都有发生m6A修饰。 m6A修饰主要发生在RRACH序列中的腺嘌呤上，其功能由“编码器(Writer)”、“消码器(Eraser)”和“读码器(Reader)”决定。“编码器(Writer)”即甲基转移酶，目前已知这个复合物的成分有METTL3，METTL14, WTAP和KIAA1429；而ALKBH5和FTO作为去甲基酶（消码器）可逆转甲基化；m6A由m6A结合蛋白识别，目前发现m6A结合蛋白（读码器）有YTH结构域蛋白（包括YTHDF1, YTHDF2,YTHDF3， YTHDC1和YTHDC2）和核不均一蛋白HNRNP家族（HNRNPA2B1和 HNRNPC）。在基因表达、蛋白翻译和RNA剪切等正常生物过程中具有重要作用。近来有研究显示m6A RNA甲基化在乳腺癌、恶性血液病、胶质母细胞瘤、宫颈癌等多种癌症的发生发展中具有重要作用。

 
       图 1 m6A修饰的酶系统               图 2 m6A生物学功能


一、MeRIP-seq实验流程

图3 英拜 m⁶A RNA甲基化测序实验流程

二、m6A甲基化测序分析内容

u  测序数据质量评估及QC

u  测序序列与参考基因组比对

u  RNA甲基化peak calling                  

u  peak在基因组中的分布及注释

u  Peak在基因组中富集程度统计   

u  差异RNA甲基化区域分析

u  差异RNA甲基化区域GO与KEGG富集分析 

三、研究案例

1、m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program. Cancer Cell 2017.(IF=27.4)
    DNA甲基化异常是胶质瘤的表观遗传调控因子，但RNA甲基化在肿瘤包括恶性胶质瘤（GBM）中的调控还尚未清楚。为研究m6A调节可能导致GBM患者临床疗效不佳，作者通过TCGA数据库，发现ALKBH5在恶性胶质瘤样干细胞（GSCs）中高表达且与GBM 病人不良预后相关，干扰ALKBH5  降低GSCs细胞的自我更新能力且抑制GSCs增殖，进一步体内验证敲除ALKBH5可抑制肿瘤生长。
    为研究ALKBH5的m6A作用机制，作者利用芯片和m6A-seq筛选到胶质瘤增殖相关的FOXM1，最后通过qPCR、WB、免疫荧光、核质分离WB/qPCR、RIP和MeRIP等实验证明ALKBH5通过去甲基化调节FOXM1在GSCs中的表达。
    为研究ALKBH5对FOXM1的作用是否受其他因子的调节，作者研究了FOXM1的邻近基因，发现lncRNA FOXM1-AS与FOXM1序列互补，且共表达、共定位，进一步通过RIP, RNA pull down等实验证明lncRNA FOXM1-AS促进ALKBH5 和FOXM1初级转录本的相互作用。最后通过细胞实验进一步验证ALKBH5在lncRNA FOXM1-AS的作用下维持FOXM1的表达和细胞增殖，从而维持GSCs的干性。

四、送样要求

A样品要求：

1. 样品类型：细胞、新鲜组织或RNA样品。

2. 样品量：细胞样品请提供至少5×10⁷~10⁸个细胞，组织样品请提供至少5g的组织块，RNA样品请提供500μg以上的总RNA。

3. 样品质量：RNA无明显降解，提取的总RNA OD260/280值在1.8～2.2之间，浓度 ≥ 500ng/μl，28S:18S ≥ 1.5，RIN ≥7。

4. 样品保存：细胞样品或新鲜组织块（切成～50mg的小块）可用TRIZOL或RNA保护剂处理或液氮冻存后，-80℃保存。RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中，-80℃保存。样品保存期间避免反复冻融。

5. 样品运输：样品置于1.5 ml管中，封口膜封好，干冰运输。