FISH原位杂交
microRNA原位杂交 RNA原位核酸杂交(RNA nucleic acid hybridization in situ)又称RNA原位杂交(RNA in situ hybridization RISH)。该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交)，所形成的杂交体(Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的RNA分子。现在探针标记技术有生物素、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶和荧光素。 microRNA原位杂交实验流程: 
 具体实验操作步骤 1、脱蜡： 1）二甲苯脱蜡3次，每次5min； 2）100％酒精两次，每次2min； 3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。 2、蛋白酶处理: 1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。 2） 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。 3） ×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。 4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。 3、变性： 1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液； 2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸； 3）78℃孵育8min； 4） 即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min； 5）空气干燥。 4、杂交： 1）准备探针； 2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片； 3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片； 4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。 杂交后的水洗： 5）镊子小心去除盖玻片； 6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min； 7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min； 8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。 检测： 9）从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。 10）每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗-抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min； 11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min。 扩增： 12）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出； 13）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min； 14）去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min； 15）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出； 16）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min； 17）1×PBS室温下洗3次，每次2min。 5、细胞核染色： 1）张切片加10μl～20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml； 2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。 |
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