单细胞实时定量PCR技术服务

单细胞实时定量PCR技服务
    单细胞qRT-PCR是在单细胞水平上对基因的表达进行实时定量分析的技术。常规的qRT-PCR所得结果是数以百万计的细胞的平均水平，只能说明基因在一个细胞群中大致的表达情况。由于细胞的异质性，相同组织的单个细胞实际上可能彼此不同，并扮演不同的角色。单细胞qRT-PCR技术不仅避免了组织水平分析时造成的异质细胞干扰,使得基因表达研究更加精细、准确，而且还能够检测导致细胞分型甚至细胞间惟一差别的表达特征，因而获得了极大关注。
    单细胞qRT-PCR技术为从单核苷酸水平深入研究癌症发生、发展机制及其诊断、治疗提供了新的研究思路并开辟了新的研究方向。近年来，该方法还被广泛应用于组织器官内细胞基因组的异质性研究、干细胞的异质性研究、以及临床指导的病理研究等各个方面。
 

实验流程：
    由于单个细胞中的mRNA数量很少,大约只有1 pg左右,因而与常规的RT-PCR相比,单细胞RT-PCR在各个环节上都有着显著差异。常规RT-PCR首先要将组织中的mRNA或总RNA抽提出来之后才能进行后续步骤,单细胞RT-PCR显然无法进行抽提步骤,因而在获取单个细胞后,在适当体积的裂解液中将细胞裂解,然后直接以裂解产物为模板进行RT-PCR。由于没有抽提,裂解产物中含有蛋白质、RNA以及基因组DNA等各种成分,蛋白质因其量极其稀少,可以忽略对单细胞RT-PCR的影响,但裂解产物中的基因组DNA相对于mRNA却有可能造成极大的干扰。避免这一影响有两种处理,一是在进行逆转录之前先用DNAaseⅠ消化基因组DNA,另一种方法就是在设计PCR引物时尽量使引物结合序列跨越相邻外显子的结合处。

参考文献：
Kiyomi T, Tomoharu K, Hideki K(2009) Quantitative analysis of gene expression in a single cell by qPCR.Nat Methods. 6(7):503-6.
Honsa P, et al. (2016) Generation of reactive astrocytes from NG2 cells is regulated by sonic hedgehog. Glia.
Andrew MD, et al. (2013) Data exploration, quality control and testing in single-cell qPCR-based gene expression experiments. Bioinformatics. 29 (4): 461-467.
White AK, et al. (2011) High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR.Proc Natl Acad Sci USA.108(34):13999-4004.