microRNA-circRNA(lncRNA) 靶基因验证实验

    环状RNA(circRNA)和长链非编码RNA(lncRNA)是一类非编码RNA,不翻译蛋白。但在细胞中它们能够调控其他基因的表达变化。近年的研究表明circRNA和lncRNA分子富含microRNA结合位点，在细胞中起到miRNA海绵（miRNA sponge）的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平，这一作用机制被称为竞争性内源RNA（ceRNA）机制。因此，通过与疾病关联的miRNA相互作用，circRNA和lncRNA在疾病中发挥着重要的调控作用。研究cirRNA、lncRNA的调控机制需要先找到与cirRNA、lncRNA相互作用的miRNA，而荧光素酶报告基因实验可以用来证明miRNA与circRNA, miRNA与lncRNA的直接相互作用。


 
英拜生物microRNA报告基因实验流程：
1.  microRNA靶点的预测
利用Targetscan,miRanda,PicTar软件得到目的microRNA的预测靶点序列。
2.  获得microRNA靶点序列
根据提供的靶序列，合成两条互补的单链DNA模板。或者，设计引物PCR扩增microRNA靶基因序列(lncRNA,circRNA全长序列或靶标序列)。
3.  cirRNA靶序列克隆
将合成的两条单链退火成双链（具有粘性末端），或将PCR产物双酶切，后连入经过同样双酶切的Psicheck-2载体中，连接产物转化大肠杆菌DH5α。
4.  阳性克隆鉴定。
挑选转化的菌落，PCR筛选含有插入片段的阳性克隆，测序验证克隆的序列和目的microRNA靶序列一致。
5.  细胞转染准备
将psicheck-2报告基因载体、microRNA　mimics或microRNA negative control共转染293T或Hela细胞。
6.  荧光素酶检测
报告基因载体与microRNA　mimics或microRNA negative control共转染293T或Hela细胞24-72h后，进行双荧光素酶检测，确定目的microRNA的靶基因。
7.  整理分析数据，得出结论。
提供有microRNA靶序列的报告基因质粒、甘油保存菌株各一支。附实验报告，包括载体构建过程，鉴定记录，测序报告，细胞转染，荧光检测。