核外核孔蛋白 sPOM121 通过转录机制驱动 β-连环蛋白介导的前列腺癌进展和免疫逃逸

   细胞核基质中核孔复合体蛋白（NUP）在实体瘤（包括前列腺癌）中的作用尚不清楚。在本研究中，作者揭示了非孔隙NUP——可溶性POM121（sPOM121）的临床意义及其作为关键转录调控因子的机制作用，它增强了转移性前列腺癌的侵袭性。通过在人类样本中使用正交方法，sPOM121被鉴定为前列腺癌中主要表达的核基质NUP。无偏见的蛋白质组学和表观基因组学研究表明，sPOM121通过其C末端与染色质重塑因子SMARCA5在基因启动子位点相互作用，并定位于核凝聚体，从而重编程基因表达。事实上，sPOM121调控了一个独特的癌基因网络，包括β-连环蛋白，导致前列腺癌进展和免疫逃逸。重要的是，在患者来源的临床前和同种异体小鼠模型中靶向sPOM121/β-连环蛋白轴可以阻止前列腺癌的侵袭性，并增强抗肿瘤免疫。总之，作者的这些发现揭示了非孔隙NUP在实体瘤中以前未知的可操作的重编程功能。该研究于2025年7月发表在《Cancer Discovery》，IF 33.3分。

技术路线：

主要研究结果：

1、sPOM121促进前列腺癌的侵袭性

   为了确定促进前列腺癌发病机制的非孔隙核基质NUPs，作者在转录本水平挖掘了癌症基因组图谱（TCGA）转录组数据集，以确定仅在核基质中定位的NUPs（如sPOM121）以及既在核孔复合体（NPC）又在核基质中定位的NUPs的表达情况。这一分析发现，与正常前列腺组织相比，sPOM121是前列腺癌中上调最显著的核基质定位NUP（图1A）。值得注意的是，通过互补的正交方法，作者发现sPOM121的mRNA和蛋白表达在前列腺癌的自然病程中增加，且在晚期转移性肿瘤样本中水平最高。为了特异性检测和定量sPOM121 mRNA，作者对一组原发性和转移性前列腺癌患者的组织进行了RNA原位杂交（RNA-ISH）-RNAscope检测，使用针对其独特的非编码外显子（二和三）的探针，这些外显子位于其独特的5′非翻译区（UTR）。RNA-ISH信号分析显示，sPOM121 mRNA表达从正常前列腺到原发性前列腺癌显著增加，且在转移性样本中水平最高（图1B）。作为阳性对照，作者使用针对其独特的跨膜（TM）结构域编码外显子的探针，在相同样本中评估了与NPC相关的POM121（TM-POM121）。通过针对sPOM121 5′UTR的siRNA在多种前列腺癌细胞中验证了针对每种POM121转录本亚型的探针的特异性，该siRNA特异性地降低了sPOM121的mRNA和蛋白表达，核基质检测和RNA-ISH信号，而不影响TM-POM121。使用能检测两种POM121亚型的抗体对患者肿瘤组织进行免疫组化（IHC；图1C）和透射电子显微镜分析（图1D）揭示了sPOM121的非孔隙核基质定位。在蛋白水平对核基质sPOM121的定量证实，sPOM121在转移性前列腺癌样本中的表达最高。值得注意的是，与正常前列腺和原发性前列腺癌细胞模型相比，转移性去势抵抗性前列腺癌细胞中sPOM121的表达也更高。总之，这些结果首次确定了核基质定位的NUP——sPOM121在前列腺癌中的表达，并且随着疾病进展到晚期转移阶段，其表达增加。

   为了确定sPOM121表达对前列腺癌侵袭性的体内影响，作者使用针对其5′UTR的短发夹RNA（shRNA）评估了sPOM121耗竭的影响，该shRNA能高效耗竭sPOM121 mRNA和蛋白，而不影响TM-POM121水平。为了研究sPOM121表达对转移性疾病的影响，进行了前列腺癌细胞的尾静脉注射实验。将sPOM121耗竭的、带有荧光素酶标记的前列腺癌细胞（DU145和22Rv1）尾静脉注射到小鼠体内，诱导肿瘤负荷显著减少（图1E）并增加小鼠存活率。相反，将sPOM121过表达的前列腺癌细胞尾静脉注射到小鼠体内，与接受空载体（EV）对照细胞尾静脉注射的小鼠相比，肿瘤负荷增加，存活率降低。值得注意的是，使用患者来源的临床前模型进一步证实了sPOM121在调节前列腺癌侵袭性方面的作用。事实上，在由患者来源异种移植瘤（PDX）生成的三个类器官模型中敲低sPOM121（图1F）减少了类器官的数量和大小。此外，将sPOM121耗竭的类器官前列腺癌细胞尾静脉注射到小鼠体内，与对照组相比，小鼠存活率增加（图1G）。总体而言，这些数据表明sPOM121可能在转移性前列腺癌中发挥关键作用，并为研究其促进疾病侵袭性的机制提供了依据。

图1：sPOM121有助于致死性前列腺癌的侵袭性

2、与染色质相关的sPOM121在基因启动子处富集

   接下来，作者旨在确定sPOM121在晚期前列腺癌中的分子功能。由于sPOM121的核基质定位，作者首先研究了sPOM121与染色质的关联。为此，作者使用前列腺癌细胞模型（DU145和22Rv1）进行了亚细胞分离实验。这一分析显示，sPOM121优先富集在染色质部分，并且在sPOM121敲低后无法检测到，而全长TM-POM121则富集在核部分（图2A）。为了进一步研究与染色质相关的sPOM121的潜在作用，作者通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）评估了其全基因组定位，并发现其与启动子和5′UTR基因组区域有46%的重叠（图2B），接近转录起始位点（TSS）。有趣的是，基序分析显示sPOM121峰值高度富集RNA聚合酶II（Pol II）相关辅因子基序，如TATA盒结合蛋白相关因子1（TAF1；图2C）。事实上，使用核和染色质部分进行POM121免疫沉淀以及邻近连接分析（PLA）表明sPOM121与RNA Pol II（总Pol II、磷酸化S2和磷酸化S5 Pol II；图2D）密切相关。最值得注意的是，支持这一观察结果的临床相关性的是，与局部原发性前列腺癌组织相比，通过PLA观察到的sPOM121与磷酸化S5 RNA Pol II之间的相互作用在人类转移性前列腺肿瘤样本中显著增加（图2E）。

   此外，sPOM121峰值的基因本体分析发现了与转录相关过程、细胞-细胞粘附和细胞分裂富集的类别（图2F）。最初根据其TSS附近强烈的sPOM121 ChIP-seq峰值选择了前五个基因本体类别中的五个基因进行进一步验证，包括CTNNB1、CXXC1、PREB、CRK和ENSA（图2G），这些基因通过比较对照组和sPOM121耗竭的前列腺癌细胞的ChIP-qPCR得到了证实。这些数据表明，sPOM121定位于前列腺癌细胞核基质中基因启动子附近的活跃转录位点。

图2：sPOM121在基因启动子上优先富集

3、sPOM121通过与SMARCA5的相互作用定位于基因启动子

   为了揭示sPOM121的染色质相互作用组，作者进行了快速免疫沉淀质谱分析（RIME）实验，比较了对照组和sPOM121耗竭的细胞。在对照组和sPOM121敲低样本之间比较时，有超过250种蛋白的富集程度存在差异，其中168种（67.2%）蛋白在三种前列腺癌细胞模型中sPOM121耗竭后表达降低（图3A）。值得注意的是，sPOM121 RIME数据显示富集了与染色质结合、mRNA调节和转录相关的生物通路，表明这种可溶性NUP参与了这些过程（图3B）。根据肽段富集（最大剃刀+独特肽段）、sPOM121敲低后最大倍数变化降低（sPOM121/对照敲低）以及在所有三种细胞模型中IgG对照中缺失，对sPOM121相互作用蛋白进行排名（图3C）。值得注意的是，蛋白质组数据挖掘发现，在作者的RIME研究中与sPOM121相互作用最强的蛋白与之前显示与RNA Pol II形成复合体的蛋白重叠，包括SMARCA5、SLTM、DDX54或RBM25。

   为了验证作者的RIME数据并确定sPOM121在染色质上的最强相互作用蛋白，作者使用总蛋白或核部分进行了免疫沉淀（IP）实验（图3D）。作者发现SMARCA5是三种独立前列腺癌细胞模型中染色质部分中sPOM121的主要相互作用蛋白。这一结果通过使用相同前列腺癌细胞提取物和核部分对SMARCA5进行反向IP得到证实。随后，邻近连接分析（PLA）证实了sPOM121与SMARCA5在前列腺癌细胞核中密切相关（图3E）。这些发现在前列腺癌组织样本中通过PLA得到证实，与原发性前列腺癌样本相比，sPOM121-SMARCA5相互作用在转移性肿瘤中最高（图3F）。由于SMARCA5被发现与RNA Pol II形成复合体（见图3C），并且是作者RIME分析中仅有被鉴定为在染色质上与sPOM121特异性相互作用的蛋白（见图3D），作者旨在进一步研究它们相互作用的性质及其功能后果。

   SMARCA5（SNF2H）是ISWI家族的染色质重塑因子，专门在启动子区域促进转录激活。因此，作者研究了SMARCA5是否能够结合作者在sPOM121顺式作用元件分析中鉴定的基因。为此，作者进行了SMARCA5 ChIP-seq实验，发现其与sPOM121 ChIP-seq有很强的重叠（图3G），包括在sPOM121调控的基因中的峰值（图3H）。事实上，通过ChIP-qPCR比较对照组和SMARCA5耗竭条件，证实了SMARCA5在sPOM121调控的基因中的富集。重要的是，在SMARCA5敲低后，sPOM121在基因启动子上的占据度降低（图3I）。综上所述，这些结果表明SMARCA5在促进sPOM121定位于基因启动子位点方面起着关键作用。

图3：sPOM121通过SMARCA5相互作用定位于基因启动子

4、sPOM121的C末端对于SMARCA5的相互作用和核基质凝聚体的定位至关重要

   接下来，作者旨在研究sPOM121蛋白区域与SMARCA5的相互作用及其在基因调控中的潜在功能相关性。为此，作者生成了带有不同蛋白区域缺失的sPOM121-GFP融合突变体（图4A），这些突变体在前列腺癌细胞中稳定表达水平相似，并通过IP实验测试了它们与SMARCA5相互作用的能力。作者发现sPOM121的C末端片段对于其与SMARCA5的相互作用是必要且充分的。sPOM121的ΔC和M突变体与SMARCA5没有相互作用，而单独表达的sPOM121 C末端片段与SMARCA5相互作用（图4B）。这些结果通过反向SMARCA5 IP得到证实（图4C）。

   然后，作者研究了sPOM121 C末端缺失对与SMARCA5共调控基因启动子的结合能力。在内源性sPOM121敲低后，在表达sPOM121-GFP缺失突变体的前列腺癌细胞中进行ChIP-qPCR实验，结果表明，与全长sPOM121（sPOM121-FL）相比，sPOM121ΔC对共调控基因（CTNNB1、CXXC1和ENSA）的富集显著降低（图4D）。值得注意的是，sPOM121 C末端片段的表达挽救了这一效应（图4D）。重要的是，与sPOM121-FL相比，sPOM121ΔC突变体的表达导致sPOM121和SMARCA5共调控基因的总mRNA和新生mRNA水平降低。

   此外，详细的荧光显微镜分析显示，C末端缺失降低了sPOM121在核基质焦点的定位，而单独表达C末端片段与sPOM121-FL和sPOM121ΔC相比增加了焦点数量（图4E）。有趣的是，sPOM121的C末端富含苯丙氨酸-甘氨酸（FG）重复序列（31-33），这些内在无序区域（IDR）被报道对于形成作为转录调控中心的致癌凝聚体至关重要。这些结果促使作者评估sPOM121核基质焦点是否定位于凝聚体。支持sPOM121定位于凝聚体的证据是，作者观察到sPOM121在用生物素标记的异噁唑（b-isox）沉淀IDR蛋白时能高效沉淀（图4F）。值得注意的是，sPOM121的FG富含C末端片段主要与b-isox沉淀。此外，在用1,6-己二醇（HD）处理前列腺癌细胞后，sPOM121焦点以时间依赖的方式消失，HD是一种用于溶解凝聚体的化合物（图4G）。此外，荧光恢复后光漂白（FRAP）实验显示sPOM121在核焦点处具有动态扩散，平均半衰期为2.6±1.2秒，移动分数为0.7±0.10（图4H）。

   为了进一步阐明sPOM121定位于核凝聚体的功能作用，作者将FG重复序列中的苯丙氨酸残基突变为丝氨酸（FS）。作者发现，尽管FS突变导致sPOM121-FL和C末端片段的核基质凝聚体减少（图4I），并阻碍了sPOM121和SMARCA5对共调控靶基因的结合（图4J），但sPOM121和SMARCA5之间的相互作用仍然保持完整（图4K）。值得注意的是，这些结果在用HD溶解凝聚体并进行共IP、PLA和ChIP-qPCR实验时得到了证实，表明凝聚体有助于sPOM121-SMARCA5靶向基因启动子。为了进一步研究这一观察结果，作者生成了一个嵌合体，其中sPOM121中的FG富含C末端片段被FUS的IDR替换，FUS是一种已知能形成核凝聚体的蛋白。这种结构域替换将sPOM121重新靶向到核凝聚体（图4L），但阻碍了与SMARCA5的相互作用（图4M）。此外，免疫荧光-DNA-FISH分析显示sPOM121焦点与CTNNB1启动子在空间上共定位，而FUS-IDR嵌合体的焦点则没有。最重要的是，作者观察到FS突变体和sPOM121-FUS嵌合体显著降低了sPOM121靶基因的表达水平（图4N）。

   综上所述，这些结果表明，sPOM121影响了一个离散基因网络的转录，该基因网络在晚期前列腺癌中驱动关键的生物学特性。

图4：sPOM121的c端对于SMARCA5相互作用和定位到核质凝聚体至关重要

5、sPOM121重塑转移性前列腺癌的转录组

   为了确定sPOM121影响的转录程序，作者在sPOM121耗竭的前列腺癌细胞中联合进行了转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）和转录组分析[RNA测序（RNA-seq）]。值得注意的是，这些研究表明sPOM121敲低的RNA-seq与sPOM121和SMARCA5敲低细胞的ATAC-seq之间存在很强的重叠（图5A）。

   作者构建了一个功能性sPOM121基因签名，该签名由sPOM121和SMARCA5敲低中一致的启动子可及性变化的基因以及sPOM121敲低时表达变化的基因的交集组成（图5B）。值得注意的是，这个基因签名包括之前通过ChIP-seq鉴定的特定sPOM121和SMARCA5富集的基因启动子（图5C和D）。通过在总RNA和新生转录合成上进行qRT-PCR，进一步证实了sPOM121敲低对这些基因表达的影响。

   基于REACTOME、HALLMARK和京都基因与基因组百科全书数据库的转录组元分析揭示了sPOM121靶基因签名的独特诱导（图5E）。有趣的是，与sPOM121耗竭细胞相比，多种癌基因信号（例如，MYC和WNT/β-连环蛋白）和G2/M细胞周期（例如，G2/M检查点和姐妹染色单体分离）反应在对照细胞中显著富集，而免疫（例如，IFNα和IL6）、翻译（例如，起始和延伸）和代谢（例如，糖基化和脂肪酸）反应在sPOM121敲低后显著诱导。最值得注意的是，支持其临床相关性，作者观察到sPOM121靶基因签名在转移性温尸检前列腺癌组织中显著富集，与原发性前列腺癌相比（图5F）。

   综上所述，这些结果表明sPOM121影响一个独特的基因网络的转录，驱动前列腺癌晚期的关键生物学特性。

图5：sPOM121重新编程致死性前列腺癌

6、sPOM121通过β-连环蛋白上调促进前列腺癌的侵袭性

   接下来，作者试图确定促进转移性前列腺癌侵袭性的主要sPOM121下游效应通路。作者关注WNT/β-连环蛋白通路，因为CTNNB1（β-连环蛋白）基因表达在sPOM121耗竭后显著下降，并且已知在多种肿瘤类型中，包括前列腺癌，在肿瘤进展中发挥作用。证实sPOM121在调节β-连环蛋白水平中的作用，作者观察到sPOM121或SMARCA5耗竭降低了β-连环蛋白蛋白表达。相反，在前列腺癌细胞中过表达sPOM121导致β-连环蛋白蛋白水平增加。值得注意的是，不结合β-连环蛋白启动子的sPOM121 C末端缺失突变体无法在sPOM121内源性耗竭后挽救β-连环蛋白表达，而sPOM121 C末端片段诱导了高水平的β-连环蛋白表达。

   支持sPOM121/β-连环蛋白轴的潜在临床意义，作者观察到高sPOM121表达的肿瘤也显示出更高的β-连环蛋白蛋白水平（图6A）。在前列腺癌患者的TCGA数据集中也观察到sPOM121和CTNNB1 mRNA之间的正相关（图6B）。此外，前列腺癌细胞系也显示出类似的关联，高sPOM121表达的细胞显示出更高的β-连环蛋白水平。

   由于β-连环蛋白上调促进肿瘤侵袭性和干细胞特性，作者专注于研究sPOM121在调节这些生物学特性中的作用。为此，作者研究了单独过表达sPOM121的前列腺癌细胞以及与β-连环蛋白敲低相结合的侵袭性和成球能力。值得注意的是，作者观察到sPOM121过表达增加了前列腺癌细胞的侵袭性和干细胞特性，而这种效应在耗竭β-连环蛋白时显著被挽救。此外，活性β-连环蛋白（ΔN89）的表达部分挽救了sPOM121耗竭引起的效应。值得注意的是，体内研究表明，耗竭β-连环蛋白显著降低了sPOM121过表达细胞的肿瘤侵袭性，如通过减少肿瘤负荷（图6C）和增加小鼠存活率（图6D）所示。

   此外，基于WNT/β-连环蛋白通路可能使前列腺癌对雄激素拮抗剂（例如，恩杂鲁胺）和紫杉醇类（例如，多西他赛）治疗产生耐药性，作者研究了sPOM121表达是否可能影响这些治疗的疗效。为了测试这一假设，作者在高sPOM121水平的去势抵抗性PDX来源的类器官中耗竭了sPOM121，这反过来又降低了β-连环蛋白表达。值得注意的是，sPOM121耗竭使类器官对多西他赛和恩杂鲁胺都敏感，这种效应在过表达活性β-连环蛋白（ΔN89；图6E）时部分被挽救。此外，在表达高水平sPOM121的类器官模型中，与sPOM121耗竭的类器官模型相比，用ICG-001或PRI-724药理学靶向WNT/β-连环蛋白与多西他赛或恩杂鲁胺联合使用时效果更明显。此外，在体内，用ICG-001治疗携带由高sPOM121/β-连环蛋白表达的PDX类器官癌细胞生成的皮下肿瘤的小鼠，显著提高了多西他赛或恩杂鲁胺的疗效（图6F）。

   综上所述，这些结果表明，sPOM121通过增强癌基因（例如，WNT/β-连环蛋白）信号，促进前列腺癌进展到转移性耐药阶段。

图6：sPOM121通过调节β-连环蛋白的表达促进前列腺癌的侵袭性

7、sPOM121促进前列腺癌的免疫逃逸

   基于sPOM121在转录调控免疫生物学过程中的潜在作用（见图5E）以及WNT/β-连环蛋白通路之前已被报道在多种肿瘤类型中促进免疫逃逸，作者决定研究这一轴在前列腺癌中对这种表型的贡献。

   为了确定sPOM121是否抑制肿瘤免疫监视，作者使用小鼠前列腺癌细胞系（TRAMP-C2和MyC-CaP）和免疫能力正常的小鼠（C57BL/6和FVB小鼠）来分析抗肿瘤免疫反应。值得注意的是，sPOM121在啮齿动物中不表达，因为这种亚型是晚期进化获得的，在人科动物中被选择。事实上，作者确认小鼠前列腺癌细胞缺乏sPOM121表达。接下来，作者在TRAMP-C2和MyC-CaP细胞中表达sPOM121，并观察到sPOM121表达增加了β-连环蛋白的mRNA和蛋白水平。为了功能性研究sPOM121对免疫逃逸的影响，作者将表达sPOM121或空载体（EV）的TRAMP-C2和MyC-CaP细胞分别皮下注射到C57BL/6和FVB/N雄性小鼠中。一旦肿瘤形成，就通过瘤内注射Poly(I:C)来触发免疫反应。Poly(I:C)给药降低了对照组（EV）肿瘤的生长，而Poly(I:C)的生长抑制效应在表达sPOM121的肿瘤中消失了（图7A）。重要的是，作者观察到用Poly(I:C)处理的表达sPOM121的肿瘤中细胞毒性CD8+ T肿瘤浸润性淋巴细胞显著减少，包括通过飞行时间细胞术（CyTOF；图7B）和免疫组化分析的细胞毒性颗粒酶B阳性CD8+ T细胞。为了确定观察到的sPOM121免疫抑制效应是否通过β-连环蛋白介导，作者分析了由耗竭β-连环蛋白的sPOM121表达的小鼠前列腺癌细胞生成的肿瘤中肿瘤浸润性CD8+ T淋巴细胞，并观察到β-连环蛋白耗竭增加了CD8+ T淋巴细胞浸润（图7C），并减少了用Poly(I:C)处理的表达sPOM121的肿瘤的重量（图7D）。为了进一步确定T细胞监视对sPOM121依赖性肿瘤生长的贡献，作者将空载体（EV，对照）和sPOM121或β-连环蛋白过表达的小鼠前列腺癌细胞分别皮下注射到免疫能力正常（C57BL/6和FVB/N）或免疫能力受损（NOD/SCID）的小鼠中，后者缺乏功能性T细胞。值得注意的是，作者观察到NOD/SCID小鼠中缺乏T细胞减少了对照组和sPOM121以及β-连环蛋白过表达肿瘤之间的肿瘤生长差异。

   支持这一轴的临床相关性，高水平的sPOM121与前列腺癌患者组织样本中激活的CD8+ T淋巴细胞的浸润减少显著相关（图7E）。最后，作者研究了sPOM121/β-连环蛋白轴是否能够使免疫检查点抑制剂治疗产生耐药性。与作者对Poly(I:C)的观察类似，sPOM121表达不仅降低了抗PD-1的治疗效果，还减少了TRAMP-C2和MyC-CaP肿瘤中CD8+ T淋巴细胞的积累。重要的是，将表达sPOM121的肿瘤小鼠暴露于联合抗PD-1和β-连环蛋白抑制剂ICG-001的治疗中，显著增强了抗PD-1疗法的疗效（图7F），并提高了小鼠的存活率（图7G），这与肿瘤中CD8+ T淋巴细胞浸润的增加有关。值得注意的是，联合使用ICG-001和抗PD-1的效果在CD8+ T细胞耗竭后显著减弱。

图7：sPOM121促进前列腺癌免疫逃避

结论：

   综上所述，这些发现表明，sPOM121/β-连环蛋白轴抑制了T细胞介导的免疫反应，从而导致前列腺癌中免疫检查点抑制剂的临床疗效有限。作者的发现将sPOM121定位为核凝聚体中转录枢纽的关键协调者，该枢纽放大了如β-连环蛋白等癌基因程序，以推动前列腺癌的侵袭性。

参考文献：

Kirthika P, Jawalagatti V, Li P, Xu M, Carceles-Cordon M, Ertel A, Quinn SA, Petrylak DP, Orme JJ, Dehm SM, Antonarakis ES, Heath EI, Pandey MK, Cordon-Cardo C, Huang H, Dong H, Zhu S, Domingo-Domenech J, Rodriguez-Bravo V. Off-pore nucleoporin sPOM121 transcriptionally propels β-Catenin driven tumor progression and immune escape in prostate cancer. Cancer Discov. 2025 Jul 28. doi: 10.1158/2159-8290.CD-25-0629IF: 33.3 Q1 . Epub ahead of print. PMID: 40709833.