新型自噬抑制剂对羟基肉桂醛通过靶向LDHA磷酸化介导的代谢重编程抑制食管鳞状细胞癌

   自噬是食管鳞状细胞癌（ESCC）快速增殖的关键，其调控为治疗干预提供了有前景的途径。最近的研究阐明了自噬和葡萄糖代谢之间的相互作用，而同时靶向这两种生物过程的抗癌药物很少。在这项研究中，研究者鉴定一种天然化合物，对羟基肉桂醛（CMSP），最初由研究者的研究小组从木鳖子（CMS）中分离出来，在体外和体内模型中都对ESCC表现出显著的抗癌活性。该研究表明，CMSP通过破坏自噬通量诱导ESCC细胞系和患者来源的类器官（PDO）模型的凋亡。从机制上讲，CMSP特异性结合细胞质中的糖酵解酶LDHA，通过阻断其膜转位来阻碍其磷酸化，从而破坏其与FGFR1的相互作用。这种抑制导致糖酵解产生的乳酸减少，溶酶体酸度降低，AMPK/mTOR通路受到抑制，最终导致自噬阻断和凋亡诱导。此外，体内研究强调了CMSP通过破坏自噬在ESCC中的潜在临床应用。总之，研究者提出了一种新的治疗策略，通过同时靶向糖酵解介导的自噬来精确治疗ESCC。该研究于2026年1月发表在《Research (Wash D C)》，IF 10.9分。

技术路线：

主要研究结果：

1、CMSP促进ESCC细胞和患者来源类器官凋亡

   CMSP最初由研究者的研究团队从木鳖子（Cochinchina momordica seed, CMS）中分离得到，已有文献记载其在10至40μg/ml浓度下可抑制ESCC细胞活力。然而，其具体作用机制尚待阐明。在本研究中，研究者将不同浓度的CMSP给予ESCC细胞系和正常食管上皮细胞系HEEC。结果证实，CMSP以剂量依赖性方式有效降低ESCC细胞活力，而对HEEC增殖影响较小（图S1A和B）。此外，流式细胞术分析一致表明，CMSP以浓度依赖性方式诱导ESCC细胞凋亡（图1A和B）。另外，在CMSP处理后观察到ESCC细胞中裂解型caspase-3、caspase-8和caspase-9以及凋亡小体水平升高（图1C和图S1C）。这些发现表明CMSP显著促进ESCC细胞凋亡。

   患者来源类器官（PDOs）因其具有优于其他体外模型的疾病特征捕获能力，为验证潜在抗癌药物提供了宝贵平台。因此，研究者从新鲜解剖的ESCC组织中建立了具有三维结构的PDOs模型，两条类器官细胞系均表现出圆形形态，缺乏任何管腔结构，这是ESCC类器官的标志（图1D）。进一步结果显示了肿瘤类器官的组织学特征，与ESCC组织中观察到的特征高度相似（图1E）。随后的分析表明，CMSP以剂量依赖性方式显著抑制ESCC类器官细胞系（PDO-1和PDO-2）的生长和有机构象（图1F和G）。重要的是，PDOs活力的抑制率根据特定类器官谱系而显著不同（图S1D）。同样，TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记）染色结果显示，与对照组相比，经CMSP处理的类器官中异硫氰酸荧光素（FITC）阳性细胞比例显著更高，表明细胞凋亡（图1H），证实CMSP给药诱导ESCC类器官凋亡。

图1：CMSP促进ESCC细胞和类器官的凋亡

2、CMSP在ESCC细胞中调控自噬和糖酵解

   为深入探究CMSP诱导凋亡的分子机制，研究者对经CMSP处理或未经处理的KYSE-30细胞进行了无标记定量蛋白质组学分析（图2A）。主成分分析（PCA）显示，与对照组相比，CMSP组的PC1发生显著偏移（图S2A）。初步筛选基于|倍数变化|>2和P<0.05的标准，在CMSP组中鉴定出1,554个下调蛋白和673个上调蛋白（表S1和S2以及图S2B和C）。一致地，基因集富集分析（GSEA）显示CMSP处理组中凋亡通路显著富集（图2B）。接下来，观察到CMSP处理后差异表达蛋白显著改变的生物学功能富集于自噬、糖酵解、氧化磷酸化和AMPK通路（图2C和图S2D）。

   为进一步剖析其分子机制，研究者研究了CMSP如何影响自噬水平和糖酵解进程。首先，透射电子显微镜（TEM）显示，与对照细胞相比，自噬空泡数量显著增加（图2D和图S2E）。此外，共聚焦显微镜分析证实了CMSP对ESCC细胞瞬时表达绿色荧光蛋白（GFP）标记LC3B的自噬调节作用，且CMSP处理优先诱导GFP-LC3B点状聚集增加（图2E和图S2F），表明CMSP增加了ESCC细胞的自噬体。为进一步探索完整自噬流的特征，对自噬标志蛋白LC3B和p62进行了初步检测。因此，研究者的发现揭示了CMSP处理的ESCC细胞中LC3B-II和p62蛋白表达呈剂量和时间依赖性累积（图2F和G）。一致地，在经CMSP处理的ESCC类器官中观察到LC3B和p62水平升高（图2H）。总的来说，这些观察强烈表明CMSP处理抑制了ESCC细胞中的溶酶体降解。溶酶体酸化和自噬体-溶酶体融合对于维持功能性自噬流至关重要。因此，研究者利用串联荧光标记LC3B来提高对酸性自噬溶酶体与中性自噬体之间pH差异的认识。与上述结果一致，CMSP处理的细胞显示出黄色点状形成显著增加，但红色点状数量没有相应增加（图2I和图S2G），进一步证实了CMSP通过抑制自噬流来抑制ESCC细胞自噬。

   此外，蛋白质组学分析表明CMSP介导的自噬与氧化磷酸化和糖酵解/糖异生通路密切相关（图2J）。研究者接下来通过Seahorse分析仪评估细胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR）来研究糖酵解通量。结果显示，CMSP处理降低了整体糖酵解通量（图2K和L），同时增加了氧消耗水平（图2M和N）。这些结果共同表明CMSP同时破坏ESCC细胞中的自噬流和糖酵解。

图2：CMSP抑制ESCC细胞自噬和糖酵解

3、CMSP通过抑制自噬和糖酵解诱导ESCC凋亡

   鉴于观察到CMSP处理不仅促进凋亡，而且抑制ESCC细胞中的自噬和糖酵解，研究者进一步剖析了自噬和糖酵解抑制在CMSP诱导凋亡中的作用。众所周知，自噬和凋亡相互作用，一些研究人员认为它们是相互抑制的，各种细胞分子通过抑制自噬来增强细胞凋亡，从而导致肿瘤生长减少。在此，为进一步阐明自噬在CMSP诱导凋亡中的参与，随后使用了自噬激活剂雷帕霉素。首先，研究者的研究显示，雷帕霉素给药显著恢复了CMSP处理主要改变的LC3B-II和p62水平（图3A）。随后，经CMSP处理的KYSE-30和KYSE-150细胞表现出增殖抑制显著增加，而当雷帕霉素与CMSP联合使用时，这种效应显著减弱（图3B）。一致地，流式细胞术和裂解型caspase-3分析表明，CMSP增强了ESCC细胞凋亡，而联合使用雷帕霉素显著逆转了这一效应（图3C和D）。

   此外，采用寡霉素作为糖酵解刺激剂来阐明糖酵解在CMSP诱导凋亡中的作用。流式细胞术分析表明，寡霉素部分挽救了CMSP诱导的凋亡（图3E）。此外，寡霉素处理显著恢复了CMSP处理主要改变的LC3B-II和p62水平（图3F）。在寡霉素处理后，观察到类似的结果，即CMSP诱导的自噬流抑制被部分逆转（图3G）。总的来说，数据表明CMSP通过抑制自噬和糖酵解来促进ESCC凋亡，而糖酵解的激活可以拮抗CMSP诱导的自噬抑制。

图3：CMSP通过抑制自噬诱导ESCC细胞凋亡

4、CMSP直接与LDHA结合并通过阻断与FGFR1的相互作用来抑制其磷酸化

   为阐明CMSP诱导ESCC细胞凋亡的潜在机制，研究者合成了一种生物素标记探针（生物素-CMSP）来研究与CMSP相互作用的特定蛋白（图S3A和B）。pull-down测定显示生物素-CMSP组有一条明显的条带（图4A），随后的高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）分析鉴定出516个可能与CMSP结合的蛋白（表S3）。值得注意的是，糖酵解酶LDHA位于前5个富集结合蛋白之中（图4B和C）。进一步的pull-down/蛋白质免疫印迹试验证实LDHA蛋白为潜在靶点（图4D）。如图S3C所示，根据UALCAN和GEPIA的公共数据，与正常对照相比，ESCC样本中LDHA表达显著升高。此外，LDHA被公认为在瓦博格效应（Warburg effect）中发挥关键作用；因此，研究者假设这可能解释了CMSP在ESCC细胞中抑制糖酵解的分子机制。此外，分子对接和动力学模拟表明CMSP与LDHA蛋白相互作用，可能通过残基Tyr82、Gly96和Ala97实现（图4E）。为确认计算预测，研究者纯化了LDHA蛋白以及LDHA Y82突变体、LDHA G96突变体和LDHA A97突变体蛋白，其中分别突变了Tyr82、Gly96和Ala97（图S3D和E）。生物层干涉测定（BLI）结果显示CMSP可以与LDHA结合，Kd为3.202×10^-6，而当LDHA的Tyr82、Gly96或Ala97发生突变时，这种结合被破坏（Kd Y82突变体=2.4×10^-4，Kd G96突变体=1.1×10^-4，Kd A97突变体=5.8×10^-5）（图4F和图S3F）。这些发现提供了直接证据，表明CMSP优先与野生型LDHA而非突变体结合，表明Tyr82、Gly96或Ala97在此结合过程中起关键作用。随后，研究者采用细胞热迁移试验（CETSA）揭示CMSP在46至62°C温度范围内增强了LDHA的热耐受性（图4G）。这些发现表明CMSP特异性结合LDHA。

   然而，研究者的进一步结果表明CMSP并未改变LDHA的整体表达水平（图4H）。鉴于研究表明在Y10位点的直接磷酸化可增加LDHA的酶活性，研究者发现CMSP处理显著降低了这种磷酸化（图4I），与这一假设一致。同样，在经CMSP处理的ESCC类器官中也观察到磷酸化LDHA减少（图4J）。此外，有文献记载LDHA的磷酸化受FGFR1调控，FGFR1是一种在多种癌症中经常过度表达的膜受体酪氨酸激酶。随后，研究者对ESCC组织芯片中FGFR1和p-LDHA的表达进行了分析。结果显示，与正常组织相比，ESCC组织中FGFR1和p-LDHA显著过度表达，且在ESCC样本中FGFR1与p-LDHA表达之间存在显著正相关（图S4A）。随后，His标签pull-down试验证实了重组LDHA（rLDHA）与FGFR1（rFGFR1）之间的直接相互作用，而CMSP的存在减弱了这种相互作用（图4K），尽管CMSP不影响FGFR1表达水平，也未检测到CMSP与FGFR1之间的任何相互作用（图S4B和C）。

   考虑到FGFR1是一种膜相关蛋白，研究者假设CMSP可能影响LDHA的细胞内分布，从而抑制膜上FGFR1诱导的磷酸化。首先，观察到LDHA和CMSP均定位于细胞质中（图4L）。随后的共聚焦显微镜显示FGFR1和LDHA在细胞膜上共定位。然而，在加入CMSP后，这种共定位减少（图4M）。一致地，亚细胞分级分离分析证实CMSP处理导致LDHA的膜定位减少（图4N）。综上所述，这些发现表明CMSP在细胞内与LDHA相互作用，破坏其膜定位，并竞争性抑制FGFR1与酶的结合，从而阻碍其磷酸化。

图4：CMSP直接结合LDHA，并通过与FGFR1断开抑制磷酸化

5、CMSP通过阻碍糖酵解介导的溶酶体酸化来抑制自噬

   考虑到LDHA在需氧糖酵解中的关键作用，可以假设CMSP与糖酵解酶的相互作用对细胞中的糖酵解代谢通路产生影响。因此，采用靶向代谢组学评估CMSP处理后中心碳代谢物的变化（图5A）。根据结果，CMSP处理下糖酵解途径中涉及的大多数中间产物浓度普遍降低，而与三羧酸（TCA）循环相关的中间产物浓度升高（图5B和图S5A）。随后的分析揭示了ESCC细胞内的乳酸含量。结果显示，CMSP处理后KYSE-30和KYSE-150细胞中的乳酸产生减少（图5C），从而证实CMSP有效抑制ESCC细胞中的糖酵解及随后的乳酸产生。越来越多的发现指出乳酸在促进癌细胞溶酶体酸化和自噬中的作用，意味着CMSP可能通过调节糖酵解代谢产生的乳酸水平来影响自噬活性。吖啶橙（AO）在细胞质结构中显示绿色荧光，在完整的酸性溶酶体环境中显示红色荧光。因此，它可以作为检测溶酶体酸度和完整性变化的指标。相应地，在厄尔平衡盐溶液（EBSS）处理的ESCC细胞（阳性对照）中红色荧光增加，而在暴露于CMSP和CQ（氯喹）的细胞中显著降低（图5D和E），表明CMSP处理后溶酶体pH升高。随后，研究者评估了CMSP处理对溶酶体酶组织蛋白酶B（CTSB）和组织蛋白酶D（CTSD）表达水平的影响，以确定CMSP是否影响溶酶体功能。结果显示，CMSP以剂量依赖性和在指定时间点显著降低了CTSB和CTSD的蛋白表达水平（图5F）。为进一步验证溶酶体功能的特征，用表达GFP-LC3B的ESCC细胞与溶酶体特异性染料LysoTracker染色，以检测自噬体与溶酶体的共定位。作为阳性对照，EBSS饥饿处理显著增强了GFP-LC3B点状聚集与LysoTracker染色亚区的共定位。相比之下，在CMSP或CQ存在下，这种共定位被破坏（图5G和H）。总的来说，这些发现表明CMSP处理通过阻碍溶酶体显著抑制了ESCC细胞中的自噬。

图5：CMSP通过阻碍溶酶体酸化来抑制自噬

6、CMSP降低ESCC细胞中糖酵解调控的AMPK/mTOR通路活性

   随后，研究者探索了CMSP通过糖酵解调控抑制自噬的详细分子机制。众所周知，AMPK的激活可抑制mTOR磷酸化，从而启动自噬。此外，AMPK负责调节细胞能量稳态。因此，研究者推断CMSP通过糖酵解介导的AMPK/mTOR通路调控来抑制自噬。首先，研究者的结果表明，CMSP介导的糖酵解抑制和氧化磷酸化增强导致肿瘤细胞中AMP/ATP比率降低和乳酸产生减少（图6A）。此外，CMSP处理有效降低了KYSE-30和KYSE-150细胞中p-AMPK（Thr172）的激活，且呈剂量和时间依赖性。与此一致，p-AMPK的下游靶点p-ULK1表现出类似趋势，而p-mTOR和p-P70S6K的表达水平显著升高（图6B和C）。然而，对AMPK、ULK1、mTOR和P70S6K的整体表达水平未观察到显著影响（图S5B和C）。此外，用雷帕霉素处理逆转了这些蛋白的表达变化，进一步证实CMSP抑制AMPK信号通路（图6D和图S5D）。总的来说，研究者的发现表明CMSP通过糖酵解调控的AMPK/mTOR通路来抑制ESCC细胞中的自噬。

图6：CMSP降低了ESCC细胞中AMPK/mTOR通路活性

7、CMSP抑制自噬，从而在体内诱导ESCC凋亡

   上述结果表明CMSP通过抑制细胞自噬来诱导ESCC凋亡。接下来，为研究CMSP在体内的抑制功能，研究者使用BALB/c小鼠建立了ESCC异种移植肿瘤模型（图7A）。经过35天治疗后，与对照组相比，经CMSP（10或30 mg/kg）治疗的异种移植肿瘤在重量和体积上均表现出显著减少，而这种效应被雷帕霉素与CMSP的联合治疗部分逆转（图7B至D），表明CMSP的治疗作用可能通过抑制自噬而发生。随后的TUNEL染色结果显示，在CMSP治疗组中，FITC阳性细胞比例显著增加，表明细胞凋亡。这种效应被雷帕霉素治疗逆转，表明CMSP通过抑制自噬来诱导ESCC凋亡（图7E）。此外，对异种移植肿瘤切片进行了免疫组织化学（IHC）检测，以评估Ki67、LC3B、p62、裂解型caspase-3、p-LDHA和LDHA的表达。经CMSP治疗后，治疗组表现出Ki67水平显著降低，表明癌细胞增殖受到抑制。此外，与对照组相比，CMSP治疗组的肿瘤组织表现出LC3B、p62和裂解型caspase-3表达水平升高，同时p-LDHA表达降低。这些分子改变在CMSP与雷帕霉素联合给药后被逆转。值得注意的是，LDHA的表达保持不变（图7F和G）。这些观察结果与免疫印迹分析获得的结果一致。此外，对异种移植肿瘤切片的透射电镜（TEM）分析显示，CMSP治疗后自噬体发生累积（图7H）。为进一步评估CMSP在体内的潜在毒性，随后进行了实验。结果显示，各组小鼠之间体重没有显著差异（图S6A）。各组之间天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、尿素（UREA）和肌酐（CREA）的血清水平相当（图S6B）。此外，主要器官的hematoxylin和伊红（H&E）分析显示，CMSP组内没有显著的肝脏和肾脏损伤、肺毒性或脾脏炎症浸润（图S6C）。总的来说，这些发现表明CMSP通过在体内抑制自噬有效抑制ESCC进展并诱导凋亡，同时显示出良好的安全性。

图7：CMSP通过在体内抑制自噬诱导ESCC凋亡

结论：

   总之，研究者的研究结果阐明了CMSP、糖酵解、自噬和肿瘤细胞凋亡之间的复杂相互作用。研究者首次证明，CMSP通过与LDHA的相互作用破坏自噬通量，诱导ESCC细胞凋亡。这种相互作用导致糖酵解减少、乳酸产生抑制和AMPK/mTOR通路抑制，从而抑制细胞自噬。研究者的研究结果表明，自噬调节小分子CMSP具有在癌症治疗中作为有效治疗剂的潜力。此外，靶向糖酵解可能提供一种有前景的治疗策略。

参考文献：

Wei S, Wang J, Zhang Z, Fu Y, Zhao L, Bi Y, Li X, Dai S, Zhang C, Zhu W, Min L, Shan B, Zhao L. A Novel Autophagy Inhibitor p-Hydroxylcinnamaldehyde Suppresses Esophageal Squamous Cell Carcinoma by Targeting LDHA Phosphorylation-Mediated Metabolic Reprogramming. Research (Wash D C). 2026 Jan 12;9:1070. doi: 10.34133/research.1070. PMID: 41531896; PMCID: PMC12794202.