YTHDC2通过铜死亡抑制肺癌对EGFR-TKI的抵抗

   尽管第三代EGFR-TKIs如奥希替尼显著提高了非小细胞肺癌（NSCLC）患者的生存率，但获得性耐药仍是主要的临床挑战，其潜在机制尚不完全清楚。在本研究中，我们发现与奥希替尼敏感的患者来源的异种移植（PDX）组织和肺癌细胞系相比，奥希替尼耐药的组织和细胞系中 YTHDC2 的表达显著下调。进一步的研究表明，YTHDC2 通过促进铜死亡来克服肺癌细胞对奥希替尼的耐药性。从机制上讲，YTHDC2 以 m6A 依赖的方式与铜转运蛋白 SLC31A1 的 mRNA 中的 m6A 修饰位点结合。这种相互作用增强了 SLC31A1 mRNA 的稳定性和蛋白质表达，从而增加了肿瘤细胞内的铜转运并诱导铜死亡。此外，我们发现铜离子载体DSF通过增加 YTHDC2 的表达来克服奥希替尼耐药性。总的来说，我们的研究结果阐明了YTHDC2-SLC31A1-铜死亡轴是EGFR-TKI耐药的关键机制，并提出了逆转该耐药性的新治疗策略。本文于2025年12月发表于Oncogene（IF=7.3）上。

技术路线：

结果：

1）YTHDC2是EGFR-TKI奥西替尼耐药的关键调节因子

   为探究EGFR-TKI奥希替尼耐药性的分子机制，我们首先利用人非小细胞肺癌（NSCLC）组织建立了奥希替尼耐药和奥希替尼敏感的患者来源异种移植（PDX）模型。模型构建的示意图见图1A。我们生成了对奥希替尼获得性耐药的PDX模型。基于TGI指数，我们选择了五个敏感和五个耐药的PDX模型进行进一步研究（图1B），其代表性图像见图1C。接下来，我们对来自奥希替尼敏感和耐药PDX小鼠的肿瘤组织进行了RNA测序（RNA-seq）。分析了两组间的差异表达基因（DEGs）（图1D, E）。考虑到RNA修饰在奥希替尼耐药中的作用尚不完全清楚，我们将PDX RNA-seq的DEGs与公共数据集GSE222820（图1F）中的基因以及已知的RNA甲基化相关基因进行了交集分析。值得注意的是，只有YTHDC2和TRMT10C被确定为在所有三个来源中都重叠的基因（图1G），这表明它们可能与奥希替尼耐药性相关。为了进一步研究奥希替尼耐药性的潜在调控因子，我们分析了PDX来源的RNA-seq数据和公共数据集GSE222820中YTHDC2和TRMT10C的表达水平。与其各自的敏感对照组相比，YTHDC2的表达在奥希替尼耐药的PDX组织和PC9耐药细胞中均显著下调（图1H, I）。鉴于YTHDC2在数据集中的一致性及其与耐药性的负相关，我们优先选择YTHDC2进行机制研究。为验证这些发现，我们采用多种正交方法来评估YTHDC2的表达。免疫组化（IHC）染色（图1J）、ELISA定量（图1K）、RT-qPCR分析（图1L）和Western blot（WB）检测（图1M）共同证明，与敏感对照组相比，奥希替尼耐药PDX组织中的YTHDC2水平显著降低。这些结果为YTHDC2作为EGFR-TKI治疗中奥希替尼耐药性的关键调控因子提供了有力证据。

2）YTHDC2抑制奥西替尼耐药性

   接下来，我们研究了YTHDC2在奥西替尼耐药中的功能作用。首先，我们生成了YTHDC2稳定过表达的H1975细胞和YTHDC2敲除的PC9细胞，证实了这些操作的效率（图2A）。在奥西替尼治疗后，我们使用CCK-8测定法评估细胞活力。在H1975细胞中，与对照组相比，YTHDC2过表达显著降低了细胞活力，增加了奥西替尼的敏感性（图2B）。然而，当YTHDC2在这些过表达细胞中被敲除时，奥西替尼敏感性降低，恢复耐药性（图2B）。相反，在PC9细胞中，YTHDC2敲低显著增强细胞活力，并赋予更高的奥西替尼耐受性（图2C）。值得注意的是，在这些敲除细胞中重新引入YTHDC2表达逆转了获得性耐药，恢复了奥西替尼的敏感性（图2C）。菌落形成分析进一步证实了这些发现。在H1975细胞中，经奥西替尼处理后，YTHDC2过表达组形成的菌落明显少于对照组；然而，在这些过表达细胞中敲除YTHDC2可恢复集落形成（图2D，E）。相比之下，与对照组相比，敲除YTHDC2的PC9细胞在集落数量上没有显著差异，但重新引入YTHDC2显著减少了集落的形成（图2F，G）。总之，这些结果表明，YTHDC2过表达逆转了奥西替尼耐药性，而其缺失促进了体外耐药性。接下来，我们在体内评估了这些效应。CDX^H1975肿瘤的代表性图像（图2H）所示，经奥西替尼治疗后，YTHDC2过表达组的肿瘤体积（图2I）和重量（图2J）均较对照组显著减小。而对于CDX^PC9肿瘤（图2K），经奥西替尼治疗后，YTHDC2敲除组的肿瘤体积（图2L）和重量（图2M）与对照组无显著差异。这些发现表明，YTHDC2过表达在体内可逆转奥西替尼耐药，而敲除YTHDC2可促进体内耐药。

3）YTHDC2通过铜死亡调节奥希替尼耐药性

   我们的研究结果表明，YTHDC2在EGFR-TKI奥希替尼耐药性中发挥着关键的调控作用。为了阐明其潜在的分子机制，我们对过表达YTHDC2的H1975细胞和携带空载体的对照细胞进行了RNA测序。热图（图3A）描绘了差异表达基因。随后的GO功能分析（图3B）显示，在“铜离子结合”和“铜离子反应”等生物学过程中存在显著富集。这些过程都与铜死亡相关，表明YTHDC2对奥希替尼耐药性的调控可能涉及铜死亡。图3C提供了说明铜死亡分子机制的示意图。为了确立YTHDC2通过调控铜死亡来影响奥希替尼耐药性的作用，我们首先研究了其调节铜死亡相关代谢通路的能力。我们定量分析了奥希替尼耐药和敏感PDX组织中的关键铜死亡相关代谢物——铜、丙酮酸和α-酮戊二酸（α-KG）。如图3D–F所示：与敏感组织相比，耐药PDX组织中的铜水平显著降低（图3D），丙酮酸含量明显更低（图3E），α-KG水平也有所下降（图3F）。这些发现表明，奥希替尼耐药性与铜死亡相关代谢活性的抑制有关。接下来，我们检测了在使用铜死亡诱导剂elesclomol-CuCl2（ES-Cu）或铜螯合剂四硫钼酸盐（TTM）处理后，YTHDC2对细胞死亡和代谢物水平的影响。在过表达YTHDC2的细胞中，与对照组相比，ES-Cu处理显著增加了细胞死亡（图3G）、细胞内铜水平（图3H）、丙酮酸含量（图3I）。这些增加在很大程度上被TTM的共处理所消除。此外，在ES-Cu处理后，与对照组相比，YTHDC2过表达的细胞中铜死亡生物标志物LIAS和FDX1的表达显著降低，而HSP70的表达则显著增加（图3J）。最后，为了确立YTHDC2介导的铜死亡与奥希替尼耐药性之间的因果关系，我们测试了阻断铜死亡是否能逆转YTHDC2过表达所带来的增敏效应。在奥希替尼处理后，向YTHDC2过表达的细胞中添加TTM显著提高了细胞活力（图3K）和集落形成能力（图3L, M）。这些发现证实，YTHDC2通过调控铜死亡来调节奥希替尼的耐药性。

4）铜转运体SLC31A1是YTHDC2的靶标

   接下来，我们研究了YTHDC2通过铜死亡调控奥希替尼耐药的分子机制。作为m6A修饰的“阅读器”，YTHDC2需要结合m6A修饰的mRNA才能发挥的功能。因此，我们试图确定YTHDC2目标。为此，我们综合分析了METTL3敲低（KD, GSE46705）后的m6A-seq数据、PDX RNA-seq数据、H1975 RNA-seq数据和铜裂相关基因。将这些数据集相交后，只有SLC31A1和PDHA1是共有的（图4A）。为了进一步阐明YTHDC2与其可能的靶点SLC31A1和PDHA1之间的关系，我们利用PDX RNA-seq和RT-qPCR分析了YTHDC2、SLC31A1和PDHA1在PDX组织中的mRNA表达水平。与敏感对照相比，在奥西替尼耐药的PDX组织中，SLC31A1表达显著降低，而PDHA1表达升高（图4B）。值得注意的是，YTHDC2过表达上调了SLC31A1 mRNA水平，但PDHA1 mRNA保持不变（图4C）。为了在蛋白水平上验证这些发现，我们评估了YTHDC2过表达或敲除后SLC31A1和PDHA1的表达。YTHDC2过表达显著增加了SLC31A1蛋白水平，而PDHA1蛋白丰度没有检测到变化（图4D）。相比之下，YTHDC2敲除降低了SLC31A1蛋白的表达，而PDHA1蛋白水平保持稳定（图4E）。

   为了研究YTHDC2与其可能的靶点SLC31A1之间的相互作用，我们首先在PC9和H1975细胞中使用RNA FISH检测了它们的细胞内定位。RNA FISH显示，在PC9细胞中，YTHDC2和SLC31A1 mRNA的共定位更强，而在H1975细胞中，这种相互作用明显较弱（图4F）。为了证实直接结合，我们进行了RIP测定。结果表明，YTHDC2特异性结合SLC31A1 mRNA，但不与PDHA1 mRNA相互作用（图4G，H）。这些发现确立了SLC31A1是YTHDC2的直接靶点。接下来，ELISA分析显示，与敏感对照相比，奥西替尼耐药PDX组织中SLC31A1蛋白表达显著降低（图4I）。此外，SLC31A1蛋白水平与YTHDC2蛋白表达呈正相关（图4J）， WB（图4K）和IHC（图4L）验证了这种关系。Kaplan-Meier生存曲线显示，SLC31A1低表达患者的生存期明显长于LUAD（图4M）和LUSC（图4N）高表达患者。总之，这些发现确定SLC31A1是YTHDC2的直接靶点，其下调有助于奥西替尼耐药，并可作为肺癌的独立预后标志物。

5）YTHDC2通过靶向SLC31A1调控铜死亡

   在确定了YTHDC2通过铜死亡调控奥西替尼耐药性以及SLC31A1是YTHDC2的靶点后，我们接下来研究了YTHDC2是否通过SLC31A1调控铜死亡。SLC31A1过表达或敲除后，H1975和PC9细胞中铜死亡标志物FDX1和HSP70的WB分析显示，与对照组相比，SLC31A1过表达后，FDX1显著降低，HSP70显著升高。相反，SLC31A1敲除后观察到相反的效果（图5A）。细胞内铜（图5B）和丙酮酸（图5C）水平的测量显示，SLC31A1过表达时升高，SLC31A1敲除时降低（图5D，E）。在体内，将SLC31A1敲除的PC9细胞或野生型（WT）细胞皮下注射到胸腺裸小鼠体内产生CDX^PC9肿瘤。SLC31A1基因敲除组与对照组相比，肿瘤体积（图5F、G）、肿瘤重量（图5H）、铜含量（图5I）均显著降低。接下来，通过拯救实验证明SLC31A1介导YTHDC2对铜死亡的调控。在DMSO或ES-Cu处理后，对YTHDC2-过表达细胞、SLC31A1敲除的YTHDC2过表达细胞或空载体对照中细胞死亡（图5J）、铜（图5K）和丙酮酸（图5L）水平的测量显示，SLC31A1敲除在很大程度上逆转了YTHDC2过表达的影响。最后，从YTHDC2敲除的PC9细胞、SLC31A1过表达的YTHDC2敲除的细胞或WT PC9细胞中产生CDXPC9肿瘤。代表性肿瘤图像（图5M）、肿瘤体积（图5N）和铜离子水平（图5O）显示，SLC31A1过表达挽救了ES-Cu治疗后YTHDC2基因敲除的效果。这些数据共同证明YTHDC2通过靶向SLC31A1调控铜死亡。

6）YTHDC2结合m6A修饰的SLC31A1 mRNA，维持SLC31A1 mRNA的稳定性

   作为m6A读取器，YTHDC2需要与m6A修饰的mRNA结合。因此，我们在YTHDC2结合的SLC31A1 mRNA中鉴定了m6A位点。使用SRAMP在线数据库进行预测，在位置A121、A208、A1223、A2153和A2824上发现了高置信度和非常高置信度的m6A基序（图6A，B）。对H1975和PC9细胞系的MeRIP-qPCR分析显示，m6A仅在含有A1223和A2824的区域显著富集（图6C，D）。使用生物素化的m6A一致性探针（在A1223或A2824处有或没有m6A甲基化）进行RNA下拉试验证实，YTHDC2特异性结合SLC31A1 mRNA中的这些位点（图6E，F）。为了验证这些结合位点，我们构建了SLC31A1 3 ' -UTR中预测的m6A位点的突变体（A-to-G）（图6G）。荧光素酶报告基因检测显示，这些位点的突变显著降低了H1975细胞中YTHDC2过表达诱导的相对荧光素酶活性（图6H），并消除了PC9细胞中YTHDC2敲除的作用（图6I），证实了A1223和A2824是与YTHDC2结合的功能性m6A位点。由于YTHDC2主要调控靶mRNA的翻译效率或稳定性，我们研究了其对SLC31A1的影响。过表达YTHDC2或对照的H1975细胞（图6J）中，经DMSO、环己亚胺（CHX，蛋白质合成抑制剂）或α-amanitin （RNA聚合酶II抑制剂）处理后，SLC31A1蛋白的WB分析显示，SLC31A1蛋白水平仅在α-amanitin处理后才发生变化。这表明YTHDC2可能影响SLC31A1 mRNA的稳定性。为了验证这一假设，我们使用RT-qPCR测量了过表达YTHDC2的H1975细胞或对照组（图6K），以及YTHDC2敲除或WT的PC9细胞（图6L），在Actinomycin D（转录抑制剂ActD）处理0、3和6小时后的SLC31A1 mRNA衰减率。与各自的对照组相比，过表达YTHDC2的细胞（图6K）和敲除YTHDC2的细胞（图6L）中SLC31A1 mRNA衰减速度明显较慢。这些结果表明YTHDC2与m6A修饰的SLC31A1 mRNA结合并增强其稳定性。

7）DSF通过靶向YTHDC2调节铜死亡，改善奥西替尼耐药性

   在确定YTHDC2通过m6A依赖性结合SLC31A1 mRNA调节铜死亡介导奥希替尼耐药后，我们筛选了FDA批准的靶向YTHDC2的小分子药物来克服耐药。筛选了100个化合物的文库，以确定它们抑制H1650和H1975细胞活力和增加YTHDC2表达的能力，鉴定出8-Hydroxyquinoline（HQ）、Chloroquine（CQ）和双硫醚（DSF）是最有效的抑制剂（图7A）。对HQ、CQ和DSF处理的H1650和H1975细胞中YTHDC2和SLC31A1蛋白及mRNA水平的分析显示，三种药物均能提高表达，其中DSF的效果最好（图7B）。因此，我们选择DSF进行进一步的研究。然后，细胞活力测定表明，与DSF共处理显著增强了H1650（图7C）和H1975（图7D）细胞对奥希替尼的敏感性。在用DMSO或DSF治疗奥希替尼后，与对照组相比，DSF处理组中YTHDC2和SLC31A1的mRNA（图7E）和蛋白（图7F）水平，以及细胞内铜（图7G）和丙酮酸（图7H）水平均上调。最后，拯救实验进一步证实了DSF的作用机制。代表性菌落图像（图7I）和定量分析（图7J）表明，DSF通过靶向YTHDC2克服了耐药性。同样，与单独使用奥西替尼相比，DSF和奥西替尼治疗来自YTHDC2过表达细胞的CDX^H1650肿瘤（图7K中的代表性图像）导致肿瘤体积（图7L）和铜含量（图7M）减少。然而，在SLC31A1敲除YTHDC2过表达细胞衍生的肿瘤中，这种DSF介导的增敏作用显著减弱。综上所述，这些发现表明DSF靶向YTHDC2调节铜死亡并克服奥西替尼耐药性。

结论：

   我们的研究阐明了对EGFR-TKIs获得性耐药的新机制。我们发现YTHDC2以m6A依赖的方式靶向SLC31A1，通过促进铜死亡克服肺癌细胞中的奥希替尼耐药。这些发现为管理对EGFR-TKIs的获得性耐药提供了新的见解和潜在的治疗策略。

参考文献：

Luo J, Xu X, Chen Y, Huang Y, Huang Y, Zhang Y, Ma L, Chen T. YTHDC2 inhibits the resistance of lung cancer to EGFR-TKI through cuproptosis. Oncogene. 2025 Dec 16. doi: 10.1038/s41388-025-03660-1. Epub ahead of print. PMID: 41402633.