HRD1通过抑制SNAP29的液-液相分离负调控自噬溶酶体的形成

   自噬是一种高度保守的细胞过程，其中细胞质内容物被自噬体分离并输送到溶酶体进行降解。SNARE蛋白介导的降解性自噬溶酶体的产生至关重要；然而，控制这一过程的监管机制仍有待探索。本研究旨在证明E3泛素连接酶HRD1调节SNAP29的液-液相分离（LLPS），从而调节SNARE组装。研究者发现，HRD1缺乏会增强自噬活性，并以SNAP29依赖的方式促进自噬溶酶体的形成。研究者还确定SNAP29在体内和体外形成高度动态的缩合物，这对SNARE复合物的组装至关重要。从机理上讲，HRD1与SNAP29相互作用以抑制其凝结，而HRD1的耗尽加速了SNAP29凝结物的形成和SNARE复合体的组装。研究者的研究结果表明，HRD1通过与SNAP29相互作用，抑制其LLPS过程，从而调节SNARE成分之间的结合亲和力，在自噬溶酶体形成中起负调节作用。该研究于2026年1月发表在《Cell Reports》，IF 6.9分。

技术路线：

主要研究结果：

1 HRD1缺乏促进哺乳动物细胞自噬

   为研究HRD1在自噬过程中的作用，研究者首先监测了LC3的转化。LC3-I是LC3的非结合形式，在细胞内呈弥散分布。它可以与Phosphatidylethanolamine结合，转化为脂化形式的LC3-II，后者与自噬膜结构相关联。通过Western blot分析评估脂化LC3的转化比例。在营养充足条件下，与对照细胞相比，HRD1小干扰RNA（siRNA）处理在三种不同细胞系（HeLa、SH-SY5Y和HEK 293T）中均导致脂化LC3（LC3-II:LC3-I）的转化比例显著增加（图S1A-S1F）。此外，研究者通过CRISPR-Cas9制备了HRD1敲除（KO）HeLa细胞系，并验证了这些细胞中脂化LC3水平和转化比例的增加（图1A和S1G-S1I），同时LC3 mRNA上调（图1B）。在HRD1 KO细胞中，与对照细胞相比，观察到内源性LC3斑点积累增加（图1C和1D）。这种积累通过外源性表达HRD1得以逆转，但E3催化突变体C329S不能逆转（图1E和1F）。

   LC3-II:LC3-I比例的增加可能反映自噬流增强，或自噬过程在吞噬泡启动后的下游步骤被阻断。为检验这些可能性，研究者用Torin1（mTOR的强效抑制剂，用于诱导自噬过程）或Bafilomycin A1（Baf.A1，液泡型H+-ATP酶的特异性抑制剂，用于阻断自噬）处理细胞。与对照相比，HRD1 KO细胞在两种处理后均表现出LC3-II:LC3-I比例和LC3斑点计数增加（图1G-1J、S1J和S1K），表明HRD1 KO细胞中自噬活性增强。此外，VPS34-IN1（选择性VPS34抑制剂）减弱了HRD1缺陷细胞中的LC3-II积累，提示磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）相关机制参与了LC3的过度积累（图1K、1L、S1L和S1M）。为进一步研究HRD1 KO细胞中的自噬进展，研究者使用了串联RFP-GFP-LC3报告基因：黄色斑点（RFP+-GFP+-LC3）代表吞噬泡和未成熟自噬体，红色斑点（RFP+-GFP--LC3）代表与酸性溶酶体融合后的成熟自噬体（GFP荧光在溶酶体区室中被淬灭）。在营养充足条件下，HRD1缺失细胞中观察到红色斑点数量增加，而对照细胞中大多数斑点为黄色（图1M和1N）。因此，HRD1功能缺失加速自噬流。

   与对照细胞相比，HRD1缺陷细胞表现出核心自噬相关因子（包括SNARE组分）的蛋白质水平未改变（图1O、1P、S1N和S1O）。此外，HRD1 KO细胞中mTORC1底物eIF4E-BP1的磷酸化水平保持不变（图S1P和S1Q），表明mTORC1活性未受影响。HRD1 KO细胞中剪切的Xbp-1 mRNA水平也未改变（图S1R）。然而，HRD1缺失导致经典内质网应激标志物BiP上调，但磷酸化eIF2α（p-eIF2α）未上调（图S1S和S1T），表明诱导了轻度内质网应激。衣霉素（TM）诱导的内质网应激增加了脂化LC3水平，但未加速自噬流（图S1U-S1Z）。因此，HRD1 KO细胞中的自噬激活独立于核心自噬基因表达或mTORC1抑制。虽然内质网应激可能促进这种激活，但它不能完全解释HRD1缺失特有的显著加速的自噬流。

图1 HRD1缺失细胞中自噬通量加速

2 HRD1缺乏促进自噬体成熟

   饥饿诱导的自噬通过四个核心阶段进展：Ω体成核、吞噬泡扩展、自噬体闭合和自噬体-溶酶体融合。研究者通过将LC3点与阶段特异性标志物可视化来确定HRD1缺失影响自噬的哪个步骤。在自噬启动期间，ULK1复合物组分是必需的。饥饿1小时后，与对照相比，HRD1 KO细胞表现出ULK1和FIP200斑点计数未改变（图2A-2C）。然而，在HRD1缺陷细胞中，LC3结构与ULK1和FIP200斑点分离，而对照细胞中保持强共定位（图2A、2B和2D）。这一发现表明，在HRD1缺失细胞中，LC3标记的结构从成核机器上解离。ATG14是PI3K3C复合物的组分。在营养耗竭条件下，HRD1功能缺失后LC3斑点与ATG14斑点解离，但在对照细胞中与ATG14斑点强关联（图2D和2E）。WIPI2专门与Ω体/吞噬泡相关联，在饥饿期间HRD1缺陷细胞中也显示出LC3共定位降低（图2D和2F）。重要的是，HRD1缺失细胞中ATG14和WIPI2斑点数量保持不变（图2C、2E和2F）。因此，HRD1可能在Ω体成核和吞噬泡扩展阶段之后的自噬中发挥作用。与HRD1缺失细胞中饥饿期间观察到的解离相反，对照细胞在内质网应激下保持LC3与早期自噬标志物的强共定位（图S2A-S2F）。

   为评估HRD1在自噬体闭合中的功能，研究者进行了荧光蛋白酶保护（FPP）测定。用Torin1处理的表达GFP-LC3的细胞在用洋地黄皂苷透化后暴露于蛋白酶K（PK）。如果GFP-LC3锚定在未闭合的膜结构上，其荧光将被淬灭（图2G）。结果显示，对照细胞中约40%的GFP-LC3斑点在PK处理后消失，而HRD1缺失细胞表现出显著降低的淬灭（图2H和2I），表明HRD1缺失细胞中有更多GFP-LC3标记的闭合结构。这些结果证明HRD1缺失细胞中闭合自噬体或自噬溶酶体增加。因此，HRD1功能缺失不阻断早期步骤（启动和闭合），而是加速自噬体成熟，导致自噬体从启动到闭合再到融合的快速转变。总之，HRD1缺失促进自噬体成熟。

图2 HRD1缺乏促进自噬体成熟

3 HRD1缺失促进自噬溶酶体形成依赖于SNAP29

   为探索HRD1在自噬溶酶体形成中的作用，研究者在营养充足条件下检查了LAMP1与斑点状LC3的共定位。与对照细胞相比，HRD1缺失增加了内源性LAMP1与斑点状LC3的共定位（图3A和3B），表明自噬体-溶酶体融合增强，这通过外源性表达HRD1得以挽救，催化突变体C329S的存在部分挽救（图S3A和S3B）。这一发现得到LysoTracker染色的进一步支持，显示HRD1 KO细胞中酸性溶酶体-LC3增加（图S3C和S3D）。电子显微镜（EM）分析进一步揭示，与对照细胞相比，HRD1缺失细胞在基础和Torin1诱导条件下均具有更高的自噬溶酶体丰度（图3C和3D）。因此，HRD1功能缺失促进自噬溶酶体形成。内质网应激未能增加自噬溶酶体形成（图S3E和S3F）。为确定HRD1 KO细胞中的自噬溶酶体是否具有功能，研究者评估了溶酶体酸度和酶活性。与对照细胞相比，HRD1 KO细胞中检测到更多LysoTracker和吖啶橙染色的酸性溶酶体（图3E、3F、S3G和S3H）。此外，在基础条件下HRD1 KO细胞中观察到增加的DQ-BSA斑点，这反映溶酶体酶活性（图3F和3G）。重要的是，半乳凝素3染色显示损伤的内体或溶酶体未增加（图S3I和S3J），证实了HRD1缺陷诱导的功能完整性。

   鉴于SNAP29在自噬体-溶酶体融合中的重要作用，研究者检查了其对HRD1 KO细胞中自噬溶酶体积累的贡献。在用靶向SNAP29的siRNA处理的HRD1 KO细胞中，研究者观察到LAMP1和LC3共定位降低（图3H、3I和S3K）。研究者进一步研究了SNAP29是否参与HRD1 KO细胞中加速的自噬流，发现SNAP29敲低（KD）使HRD1 KO诱导的自噬溶酶体（RFP+-GFP--LC3）在营养充足条件下恢复为未成熟自噬体（RFP+-GFP+-LC3）（图3J和3K）。因此，SNAP29在HRD1缺失驱动的自噬溶酶体形成中发挥关键作用，提示其参与HRD1 KO中观察到的增强自噬活性。

图3 HRD1的耗竭促进自溶酶体的形成，且依赖SNAP29

4 SNAP29在体内形成高度动态的凝聚体

   在正常营养条件下，内源性SNAP29主要在细胞质内观察到少数弱斑点结构（图S4A）。饥饿或Torin1处理触发大量明显的亮SNAP29斑点结构积累（图S4A和S4B）。类似地，外源性SNAP29-GFP在这些自噬诱导条件下形成丰富的斑点（图4A和4B）。为更好地及时和空间检查SNAP29斑点的形成，研究者在活细胞中采用了Opto-droplets系统。SNAP29与蓝光诱导性自寡聚蛋白CRY2串联连接，此后称为Opto-SNAP29（图4C）。蓝光诱导后，转染Opto-droplets系统空对照质粒（此后称为Opto-control）的细胞未表现出显著变化，而Opto-SNAP29在细胞质中迅速形成小的明显斑点，并随时间演变为较大的凝聚体（图4D）。Torin1处理放大了Opto-SNAP29液滴形成（图S4C和S4D）。为表征SNAP29斑点结构的特性，研究者首先研究了1,6-己二醇（1,6-hex）处理后的变化，1,6-己二醇是一种破坏弱疏水相互作用的脂肪醇。结果，在正常、饥饿或Torin1处理条件下，外源性SNAP29-GFP液滴在3.5% 1,6-hex处理后减少（图4A和4B）。Torin1处理期间的荧光恢复后光漂白（FRAP）分析证明SNAP29在漂白后快速荧光恢复（图4E和4F）。Torin1处理后，活细胞成像进一步捕捉到Opto-SNAP29凝聚体之间的动态融合事件（图4G）。总之，SNAP29液滴在体内高度动态和移动。

图4 SNAP29在体内和体外接受LLPS检查

5 SNAP29在体外经历LLPS

   观察到的体内动态促使研究SNAP29的体外相分离。SNAP29是一种具有广泛无序区的内在无序蛋白（图4H）。从大肠杆菌纯化的重组His-SNAP29和His-TagRFP-SNAP29（称为TagRFP-SNAP29）最初在高盐缓冲液中溶解，然后通过稀释到含5% PEG-8000（拥挤剂）的生理盐缓冲液中诱导LLPS。20 μM His-SNAP29和TagRFP-SNAP29均通过LLPS形成类液滴凝聚体，其大小呈浓度依赖性（图4I和S4E-S4G）。沉降实验为LLPS发生提供了额外证据（图4J）。此外，通过研究液滴的液体特性，研究者观察到与对照组相比，1,6-hex处理后预形成液滴收缩以及融合事件（图4K-4M）。FRAP测定进一步证明SNAP29 LLPS凝聚体具有高移动性，快速荧光恢复（<10秒）（图4N和4O）。这些结果表明SNAP29经历LLPS并在体外表现出高动态性。

6 动态SNAP29是SNARE复合物组装所必需的

   在哺乳动物细胞中，STX17-SNAP29-VAMP8 SNARE复合物（包括自噬体Q-SNAREs（STX17为Qa，SNAP29为Qbc）和溶酶体R-SNARE VAMP8）介导自噬体-溶酶体融合。为研究SNAP29 LLPS是否促进SNARE复合物组装，研究者在营养充足条件下将STX17-GFP与光诱导性Opto-control或Opto-SNAP29构建体共表达。最初，STX17-GFP表现出网状和管状结构（图S5A）。蓝光诱导触发Opto-SNAP29凝聚体快速形成，驱动STX17逐渐重新分布到与LLPS焦点共定位的斑点结构中，而在Opto-control细胞中不存在；Opto-control（olig）是Opto-control构建体的改良版本，形成丰富的光诱导聚集体，未能募集STX17，证实该效应专门由SNAP29的LLPS驱动（图S5A-S5D）。SNAP29 KD细胞中饥饿诱导的外源性STX17-GFP斑点形成减少（图5A和5B）。此外，无论Opto构建体转染如何，核周VAMP8簇在光诱导前持续存在（图S5E）。蓝光激活后，Opto-SNAP29凝聚体募集VAMP8斑点，促进其在整个细胞质中分散，而VAMP8在Opto-control细胞中保持核周分布（图S5E-S5H）。类似地，饥饿诱导的VAMP29重新分布同样需要SNAP29存在（图5C和5D）。因此，SNAP29是重塑STX17定位和实现VAMP8空间分布所必需的。

   体外重组证明纯化的STX17（1-228）和VAMP8（1-75）被整合到SNAP29凝聚体中（图5E），为SNAP29 LLPS协调SNARE复合物组装提供了直接生化证据。使用已知因O-GlcNAcylation缺陷而形成增加斑点的SNAP29（QM）突变体，研究者确认其增强的LLPS能力（图S5I和S5J）。这种LLPS增强的突变体将更多STX17和VAMP8募集到复合物中（图S5L和S5M），从而促进自噬溶酶体形成（图S5I和S5K）。研究者进一步研究了这些动态斑点结构在细胞过程中的作用。在共转染STX17-GFP或VAMP8-GFP以及Opto质粒（Opto-control或Opto-SNAP29）和BFP-LC3的细胞中，研究者观察到SNAP29、STX17或VAMP8随时间与LC3共凝聚（图5F、5G、S5N和S5O）。然而，研究者在Opto-control细胞中未观察到这一现象（图5F、5G、S5N和S5P）。总之，SNAP29 LLPS对于成核STX17-SNAP29-VAMP8 SNARE复合物和驱动自噬体-溶酶体融合是必需的。

图5 SNAP29 LLPS启动SNARE复物组装

7 HRD1抑制SNAP29凝聚体形成

   研究者研究了HRD1对SNAP29凝聚体形成的影响。在HRD1缺失细胞中，研究者观察到内源性（饥饿条件下）和外源性SNAP29的斑点形成显著增加（图6A-6D）。外源性SNAP29斑点的增加被外源性HRD1表达抑制，并被C329S突变体部分挽救（图S6A和S6B）。蓝光诱导后，与对照细胞相比，HRD1 KO细胞表现出更多Opto-SNAP29凝聚体形成（图S6C和S6D）。HRD1是一种六次跨膜结构域蛋白；研究者将其膜内区域指定为"TM"，细胞质部分指定为"Cyto"（图6E）。在体外LLPS测定中，添加HRD1（Cyto）抑制SNAP29液滴组装，导致较小的凝聚体（图6F和6G）。分子间静电相互作用对相分离的调节至关重要。研究者生成了具有八个精氨酸-丙氨酸替换（R8A）的HRD1突变体（图6E）。该突变体减弱了HRD1（Cyto）对SNAP29凝聚体形成的抑制作用（图6F和6G）。

   为进一步表征HRD1-SNAP29相互作用，GFP-trap测定确认了体内结合（图6H）。值得注意的是，SNAP29优先与HRD1（Cyto）共沉淀，而不与TM结构域共沉淀（图6H和6I）。体外结合测定重现了这种相互作用，HRD1（Cyto）的带正电荷突变体（R8A）表现出对SNAP29的亲和力降低（图6J和6K）。研究者还确定HRD1与SNAP29的相互作用在营养充足条件下强于饥饿期间（图S6E和S6F）。功能验证显示，外源性HRD1-GFP表达显著抑制HRD1 KO细胞中增加的LC3-LAMP1共定位，而相互作用缺陷突变体HRD1（R8A）损害了这种挽救效应（图S6G和S6H）。因此，HRD1与SNAP29的相互作用对于抑制SNAP29 LLPS和调节自噬溶酶体形成至关重要。

图6 HRD1抑制SNAP29 LLPS过程

8 HRD1缺失加速SNARE复合物组装

   鉴于SNAP29 LLPS对SNARE组装至关重要且被HRD1抑制，研究者研究了HRD1是否参与SNARE蛋白组装的调节。饥饿时，与对照细胞相比，在HRD1缺失细胞中观察到内源性STX17和VAMP8被SNAP29-GFP-Trap沉淀增加（图7A和7B）。在营养充足条件下，HRD1 KO细胞表现出LC3与SNARE蛋白（SNAP29、VAMP8和STX17）斑点的共定位增强（图S7A-S7E）。此外，在HRD1缺失细胞中，SNAP29和VAMP8斑点均表现出与STX17阳性LC3斑点的共定位增加（图7C、7D、S7F和S7G）。因此，HRD1功能缺失促进STX17-SNAP29-VAMP8复合物的组装。已知系留因子如HOPS复合物和EPG5促进SNARE复合物组装，而EPG5 KD损害细胞中的自噬体成熟。然而，这种损害被HRD1功能缺失部分挽救（图7E、7F和S7H），进一步证实HRD1功能缺失促进自噬体成熟。因此，HRD1缺失促进SNARE组装并促进自噬溶酶体形成以及自噬体成熟。

图7 HRD1耗尽促进SNARE复物组装

结论：

   本研究揭示了E3泛素连接酶HRD1通过其细胞质结构域与SNAP29直接结合，抑制SNAP29发生液-液相分离（LLPS），从而负向调控自噬体-溶酶体融合和自噬溶酶体形成；HRD1缺失时，SNAP29从弥散状态转变为高度动态的液滴样凝聚体，加速募集STX17和VAMP8组装SNARE复合物，促进自噬流和自噬溶酶体生成，建立了SNARE蛋白相分离作为自噬调控关键机制的新范式。

参考文献：

Qu W, Chen D, Zhao H, Sheng Q, Wang J, Shen Y, Shen Y. HRD1 negatively regulates autolysosome formation by inhibiting liquid-liquid phase separation of SNAP29. Cell Rep. 2026 Feb 24;45(2):116914. doi: 10.1016/j.celrep.2025.116914. Epub 2026 Jan 29. PMID: 41615796.