m6A修饰与DNA修复“跨界”联动：胶质母细胞瘤TMZ耐药的新机制被揭示

   胶质母细胞瘤（GBM）是一种侵袭性强、易复发且预后不良的恶性肿瘤。尽管替莫唑胺（TMZ）是GBM治疗的基石，但其疗效常因固有或获得性耐药而受限，这凸显了揭示分子机制、发现新的治疗靶点以及开发创新治疗策略的紧迫性。在本研究中，我们发现TMZ耐药性GBM细胞核内丝状肌动蛋白（F-actin）的形成增加。我们还证明，TMZ耐药性GBM细胞中FSCN1的过表达会促进F-actin的形成，并加速DNA双链断裂（DSBs）的修复。进一步研究揭示，TMZ耐药性GBM细胞中YTHDC1的表达显著下降，而该蛋白正是通过m6A修饰调控FSCN1的。此外，FSCN1通过招募FGD1激活CDC42GTP，从而激活CDC42/N-WASP/Arp2/3信号通路，进而驱动核内F-actin的形成。重要的是，将FSCN1抑制剂NP-G2-044与TMZ治疗联合使用，在体外和体内均产生了更强的抗肿瘤效应。综上所述，该研究证实GBM中的核F-actin形成促进了DSB修复，并揭示了通过NP-G2-044靶向FSCN1可能是提高治疗效果、改善GBM患者预后的有前景的策略。该研究于2026年3月发表在《Advanced Science》，IF：14.1。

技术路线

主要研究结果：

1.核F - Actin增加促进GBM细胞对TMZ的耐药性

   肿瘤细胞肌动蛋白细胞骨架的变化会影响其行为和生物功能。为了探究TMZ耐药性胶质母细胞瘤（GBM）细胞核内肌动蛋白的改变，我们使用Lifeact和一种带有核定位信号（NLS）的GFP标记质粒（NLS）的GFP标记质粒（Lifeact-EGFP-2xNLS）对GBM细胞系（LN229、U251、HG7）及其相应的TMZ耐药GBM细胞系（229R、251R、HG7R）进行了免疫荧光染色。三维视图结果显示，与亲代GBM细胞相比，TMZ耐药GBM细胞中的核F-actin含量增加，且Lifeact-EGFP-2xNLS染色的特异性优于鬼笔环肽染色（图1A；图S1A）。我们通过免疫荧光染色定量测定了细胞核内F-actin阳性细胞的比例。结果显示，TMZ耐药性GBM细胞中核内F-actin阳性细胞的比例显著增加（图S1B）。随后，吡啶-肌动蛋白实验表明，TMZ耐药性GBM细胞的核提取物比亲本GBM细胞的核提取物更能促进F-actin聚合（图1B；图S1C、D）。F-actin/G-肌动蛋白测定显示，TMZ耐药性GBM细胞核提取物中的F/G肌动蛋白比值也高于亲本GBM细胞（图1C；图S1E）。为验证这些发现，我们利用Lifeact-EGFP-2xNLS对内源性核肌动蛋白进行可视化，并通过共聚焦显微镜的Airyscan模式对其进行成像。我们观察到，在TMZ耐药性GBM细胞中，核F-actin显著增加（图1D）。

   接下来，我们旨在探讨核内F-actin在TMZ耐药性中的作用。为抑制核内肌动蛋白聚合，将TMZ耐药性GBM细胞预先用1 µM拉特鲁库林B（LatB）处理30分钟。与二甲基亚砜（DMSO）处理组相比，该处理显著减少了TMZ耐药性GBM细胞中核内F-actin的形成（图1E–G；图S1F–I）。此外，为探究F-actin与TMZ耐药性的关联，我们在抑制F-actin形成后对细胞进行TMZ处理，随后进行流式细胞术和集落形成实验。结果显示，LatB对核内肌动蛋白聚合的抑制对TMZ耐药性GBM细胞的凋亡或增殖无显著影响。然而，与仅接受TMZ处理的细胞相比，同时接受TMZ和LatB处理的TMZ耐药性GBM细胞显示出更高的凋亡率和更低的集落形成能力（图1H、I；图S1J、K）。这些结果表明，核F-actin的形成和功能在GBM细胞TMZ耐药性的发展中起着关键作用。

图1.核F - Actin增加促进GBM细胞对TMZ的耐药性

2.FSCN1调控核F - Actin形成促进DNA损伤修复

   先前研究表明，核内F-actin与DNA双链断裂（DSBs）的修复有关。为了探究核内F-actin与GBM细胞中DNA损伤修复之间的关系，我们对TMZ耐药的GBM细胞分别进行了DMSO、LatB、TMZ以及TMZ+LatB处理。我们通过免疫荧光、彗星试验和Western blot技术评估了核内DSB损伤。结果显示，单独使用LatB处理并未在TMZ耐药性GBM细胞中诱导出显著的DNA损伤变化。然而，与仅使用TMZ处理相比，TMZ与LatB联合处理导致核内DNA损伤位点、DNA损伤尾部增加，以及DSB相关标志蛋白的积累（图2A–C；图S2A–C）。接下来，我们旨在鉴定影响TMZ耐药性GBM细胞中F-actin聚合的关键分子。在针对多种肌动蛋白调节蛋白进行初步实验后，我们聚焦于肌动蛋白束缚蛋白Fascin（FSCN1）。随后，我们通过Western blot和免疫荧光实验检测了亲代及TMZ耐药性GBM细胞核内及全细胞提取物中FSCN1的表达水平。结果显示，TMZ耐药性GBM细胞的细胞核及全蛋白水平中FSCN1表达显著升高，复发性GBM患者的组织样本中亦呈现相同趋势（图2D–F；图S2D）。此外，qRT-PCR结果显示，与亲代GBM细胞和原发性GBM患者组织相比，TMZ耐药性GBM细胞和复发性GBM患者组织中FSCN1 mRNA的表达显著增加（图S2E、F）。为了研究FSCN1表达水平与GBM细胞中核F-actin形成之间的关系，我们在TMZ耐药性GBM细胞中建立了shFSCN1细胞模型。我们通过qRT-PCR和Western blot验证了FSCN1的表达，结果显示，在shFSCN1处理的TMZ耐药性GBM细胞中，FSCN1蛋白在细胞核和总细胞提取物中的表达均降低，且FSCN1 mRNA表达水平也较低（图2G；图S2G）。核F-actin的免疫荧光染色显示，在 shFSCN1 处理的 TMZ 耐药 GBM 细胞中，核F-actin的形成受到抑制（图 2H）。为进一步探索 FSCN1 的功能作用，我们分析了 TCGA 数据集的数据，并将患者分为 FSCN1 高表达组和低表达组。基因本体论（GO）分析表明，FSCN1 的表达与 DNA 双链断裂修复和 DNA 损伤修复复合体的形成有关（图 S3A）。随后，我们通过彗星实验和Western blot评估了shFSCN1处理后的DNA损伤水平。结果显示，在TMZ治疗后，shFSCN1显著增加了TMZ耐药性GBM细胞中的DNA损伤尾迹以及DNA损伤相关标志蛋白的表达（图2I、J；图S3B、C）。

图2.FSCN1调控核F - Actin形成促进DNA损伤修复

3.YTHDC1通过m6A修饰调控FSCN1表达

   基于我们之前的研究，我们利用在线工具SRAMP预测了FSCN1 mRNA上的多个高置信度和极高置信度的m6A结合位点（图3A）。为了验证这些预测，我们在GBM细胞中进行了RNA免疫沉淀（RIP）实验，使用m6A抗体和磁珠捕获与m6A结合的mRNA。纯化后，我们通过qRT-PCR检测了GBM细胞中沉淀下来的FSCN1 mRNA（图3B）。为了鉴定参与FSCN1调控的m6A甲基转移酶，我们分析了既往的测序数据集和m6A酶谱。结果显示，YTHDC1是唯一的共同因子（图S4A）。我们先前的测序数据表明，YTHDC1在TMZ耐药性GBM细胞及复发性GBM患者样本中均呈现持续下调（图S4B）。随后，我们通过RIP和沉淀实验探究了YTHDC1蛋白与FSCN1 mRNA之间的相互作用。结果表明，YTHDC1蛋白在GBM细胞中与FSCN1 mRNA发生相互作用（图3C、D；图S4C）。对公共数据库（TCGA）及临床GBM患者样本中YTHDC1与FSCN1表达的关联分析显示，两者表达呈显著负相关（图3E、F）。为进一步探讨YTHDC1蛋白对FSCN1表达的影响，我们在亲代GBM细胞（LN229、U251、HG7）中建立了s∖shYTHDC1细胞系，并在TMZ耐药GBM细胞（229R、251R、 HG7R)建立了稳定的OE-YTHDC1细胞系，并通过qRT-PCR和Western blot实验验证了YTHDC1的表达水平（图S4D、E）。随后，我们通过qRT-PCR和Western blot检测了FSCN1的表达水平，结果显示：在亲本GBM细胞中，shYTHDC1导致FSCN1表达上调；而在TMZ耐药GBM细胞中，OE-YTHDC1则抑制了FSCN1的表达（图3G；图S4F、G）。为了进一步验证 YTHDC1 蛋白与 FSCN1 mRNA 之间相互作用的特异性，我们突变了 FSCN1 mRNA 上两个高度可信的 m6A 结合位点。在 229R shFSCN1 细胞中过表达 FSCN1-wt 和 FSCN1-mut 后，我们再次过表达了 YTHDC1。Western blot 结果显示，在 229R shFSCN1 细胞中，OE-FSCN1-wt 随后 OE-YTHDC1 导致核内 FSCN1 蛋白减少，而 OE-FSCN1-mut 随后 OE-YTHDC1 则未显示核内 FSCN1 的显著变化（图 3H）。随后，我们使用放线菌素 D 抑制转录，并通过 qRT-PCR 测定了 LN229 shYTHDC1 细胞和 229R OE-YTHDC1 细胞在 0、1.5、3 和 4.5 小时时的 FSCN1 mRNA 表达水平。结果表明，随着 YTHDC1 表达的降低，FSCN1 mRNA 的衰减速率显著降低（图 3I）。

图3.YTHDC1通过m6A修饰调控FSCN1表达

4.YTHDC1在TMZ耐药的GBM细胞和复发患者中的下调与TMZ耐药相关

   为进一步研究YTHDC1在GBM组织和细胞中的表达情况，我们采用qRT-PCR技术检测了27例原发性及11例复发性GBM患者肿瘤样本中YTHDC1的mRNA水平。结果显示，复发性GBM组织中YTHDC1的表达显著降低，且在4对配对样本（原发性与复发性GBM组织）中观察到了相同的结果（图4A；图S5A）。此外，qRT-PCR分析显示，与亲代细胞相比，TMZ耐药性GBM细胞中的YTHDC1表达水平显著降低（图4B；图S5B）。Western blot结果进一步证实，与原发性肿瘤和亲代细胞相比，复发性GBM组织和TMZ耐药性GBM细胞中的YTHDC1蛋白水平均显著降低（图4C、D；图S5C）。免疫组化（IHC）染色同样显示复发性GBM肿瘤中YTHDC1蛋白水平显著降低（图4E），而免疫荧光染色则显示TMZ耐药性GBM细胞中YTHDC1蛋白水平显著下降（图4F；图S5D）。为探索 YTHDC1 表达与 TMZ 耐药性之间的关系，我们分析了 TCGA 数据库中的患者数据，结果表明，较低的 YTHDC1 表达与较差的生存结果相关（图 S5E）。随后，对GBM细胞核内F-actin进行的免疫荧光染色显示：在亲代GBM细胞中，shYTHDC1促进了核内F-actin的形成，而在替莫唑胺耐药的GBM细胞中，OE-YTHDC1则抑制了核内F-actin丝的形成（图4G；图S5F）。为了确定YTHDC1在TMZ耐药性中的功能作用，我们进行了流式细胞术凋亡检测、集落形成实验和CCK8检测。结果显示，在亲本GBM细胞中，shYTHDC1在TMZ处理下可减少凋亡并增强增殖（图4H–J；图S5G–I）。接下来，我们通过在 LN229 shYTHDC1 细胞中敲低 FSCN1，以及在 229R OE-YTHDC1 细胞中过表达 FSCN1，进行了拯救实验（图 4K）。免疫荧光染色显示，shFSCN1抑制了LN229 shYTHDC1细胞中核内F-actin的形成，而OE-FSCN1则恢复了229R OE-YTHDC1细胞中核内F-actin的形成（图4L）。经 TMZ 处理后，流式细胞术凋亡检测显示，shFSCN1 恢复了 LN229 shYTHDC1 细胞对 TMZ 的敏感性，而 OE-FSCN1 则恢复了 229R OE-YTHDC1 细胞对 TMZ 的耐药性（图 4M）。

图4.YTHDC1在TMZ耐药的GBM细胞和复发患者中的下调与TMZ耐药相关

5.FSCN1 通过招募 FGD1 激活 CDC42/N-WASP/Arp2/3 轴

   为探究FSCN1调节肌动蛋白丝形成和DNA DSB修复的机制，我们根据TCGA数据库中的基因集数据，将GBM患者分为FSCN1高表达组和低表达组。KEGG通路富集分析显示，“肌动蛋白细胞骨架调节”通路与我们的实验结果显著相关（图S6A）。进一步的基因集富集分析（GSEA）也证实，FSCN1的表达能够激活“肌动蛋白细胞骨架调控”通路（图S6B）。基于既往研究，我们发现FSCN1的表达可能与CDC42/N-WASP/Arp2/3信号轴的激活密切相关。接下来，我们通过 Western blot 评估了 LN229 和 229R 细胞中的 CDC42 激活水平（CDC42GTP）。结果显示，虽然 229R 细胞核提取物中的总 CDC42 水平未出现显著变化，但 CDC42GTP 水平却明显升高（图 5A）。比较 LN229 和 229R 细胞核提取物中的 N-WASP 和 Arp2/3 水平发现，它们的核蛋白水平没有显著差异。然而，通过使用N-WASP抗体进行免疫沉淀（IP）并定量分析Arp2，我们发现229R细胞核中与N-WASP结合的Arp2蛋白更多（图5B）。这些结果表明，在对TMZ耐药的GBM细胞中，CDC42/N-WASP/Arp2/3通路被激活。随后，我们对229R shFSCN1细胞的核提取物中该通路的激活情况进行了研究。Western blot和吲哚-肌动蛋白实验表明，shFSCN1显著抑制了CDC42的激活以及N-WASP和Arp2/3的结合（图5C–E）。鉴于FSCN1本身并不直接激活CDC42，我们进行了FSCN1免疫沉淀和质谱分析以鉴定其结合伙伴。筛选结果表明，GEF家族成员FGD1可与FSCN1结合并激活CDC42。Western blot分析显示，TMZ耐药性GBM细胞的细胞核中FGD1表达上调，且shFSCN1显著降低了FGD1蛋白水平（图5F、G）。免疫沉淀实验进一步证实了FSCN1与FGD1之间的相互作用（图5H）。随后，我们在LN229细胞中过表达FSCN1（OE-FSCN1），并通过Western blot和吡啶-肌动蛋白实验检测了FGD1的水平以及CDC42/N-WASP/Arp2/3通路的激活情况。结果表明，OE-FSCN1 提高了细胞核中 FGD1 的蛋白水平，并激活了 CDC42/N-WASP/Arp2/3 通路（图 5I、J）。随后，我们在LN229 OE-FSCN1细胞中敲低FGD1，进行了拯救实验。Western blot和吡啶-肌动蛋白检测显示，shFGD1抑制了LN229 OE-FSCN1细胞中核内F-actin的形成（图5K、L），这表明在缺乏FGD1的情况下，FSCN1无法独立激活CDC42/N-WASP/Arp2/3通路。为了探索 CDC42/N-WASP/Arp2/3 通路的治疗潜力，我们使用了 CDC42（ML141）和 Arp2/3（CK-666）的小分子抑制剂。免疫荧光结果显示，抑制 CDC42 或 Arp2/3 均可阻断 TMZ 耐药性 GBM 细胞中F-actin的形成（图 5M、N；图 S6C、D）。此外，我们利用遗传学方法在 229R 细胞中敲低 CDC42、N-WASP 和 Arp2，并通过 Western blot、吲哚-肌动蛋白检测和彗星实验评估了F-actin的形成和 DNA 损伤。结果表明，shCDC42、shN-WASP 和 shARP2 显著抑制了核F-actin的聚合，并增加了 TMZ 处理后的 DNA 损伤尾迹（图 S6E–G）。最后，在对TMZ耐药的GBM细胞进行shFSCN1或抑制剂ML141和CK-666处理后，免疫荧光分析显示，DNA DSB修复位点在TMZ处理后未能从异染色质区域迁移至其周边以进行同源重组（HR）修复（图5O–Q；图S6H–J）。为了探究FSCN1表达水平与细胞内HR修复事件发生频率之间的关系，我们利用DR-GFP系统对LN229 OE-NC、OE-FSCN1、229RshNC和shFSCN1细胞进行了检测。在有或无 ISceI 表达的情况下进行 TMZ 处理后，我们通过流式细胞术测定了 GFP 阳性细胞的百分比。结果表明，在 GBM 细胞中，FSCN1 表达越高，TMZ 处理下的 HR 修复频率就越高（图 5R）。综上所述，这些结果表明，FSCN1通过招募FGD1来激活CDC42/N-WASP/Arp2/3信号轴，从而促进DSB的修复，并促使DSB修复位点从异染色质区域向其周边迁移，以在GBM细胞中进行同源重组修复。

图5.FSCN1 通过招募FGD1 激活 CDC42/N-WASP/Arp2/3 轴

6.TMZ联合FSCN1抑制剂NP‐G2‐044治疗可在体内和体外逆转GBM TMZ耐药

   为探索TMZ联合治疗的潜在临床应用，我们选择了目前正在进行临床试验的FSCN1抑制剂NP-G2-044，该药物主要针对其在肿瘤侵袭和转移中的作用。为验证NP-G2-044在GBM细胞中对FSCN1的特异性，我们进行了细胞热变性分析（CETSA）。Western blot结果显示，NP-G2-044显著提高了FSCN1的热稳定性（图6A）。免疫荧光染色显示，在TMZ耐药的GBM细胞中，NP-G2-044处理抑制了核内F-actin的形成（图6B）。此外，在TMZ处理条件下，NP-G2-044处理显著增加了TMZ耐药性GBM细胞中的DNA损伤位点（图6C；图S7A）。Western blot结果显示，在TMZ耐药性GBM细胞中，与单独TMZ处理相比，TMZ与NP-G2-044联合处理显著提高了DNA损伤标志蛋白的水平（图6D）。CCK8细胞存活率测定表明，TMZ与NP-G2-044的联合治疗显著抑制了TMZ耐药性GBM细胞的增殖活性（图6E；图S7B）。为评估NP-G2-044对TMZ耐药性的体内影响，我们利用TMZ耐药的229R细胞系建立了小鼠原位GBM异种移植模型。移植 7 天后，小鼠每 5 天接受 TMZ（60 毫克/千克/天）单药治疗或 TMZ 与 NP-G2-044（100 毫克/千克/天）联合治疗（图 6F）。生物发光成像显示，联合治疗有效恢复了TMZ耐药异种移植瘤对 TMZ 的敏感性（图 6G）。与对照组相比，联合治疗组的动物肿瘤体积显著缩小，生存期延长（图6H、I）。综上所述，这些结果表明，TMZ与NP-G2-044的联合应用可能是克服TMZ耐药性并提高治疗效果的一种有前景的策略。

图6.TMZ联合FSCN1抑制剂NP‐G2‐044治疗可在体内和体外逆转GBM TMZ耐药

图7.在GBM中，低YTHDC1表达上调FSCN1促进核F - actin形成和促进DNA断裂修复的机制图

结论

   本研究强调了核内F-actin在驱动GBM细胞对TMZ产生耐药性方面发挥的关键作用。我们证明，FSCN1通过CDC42/N-WASP/Arp2/3通路促进核内肌动蛋白的聚合，从而增强DNA损伤修复，并导致对TMZ产生耐药性。此外，YTHDC1表达的降低会进一步上调FSCN1水平，从而强化这一耐药机制。重要的是，我们的研究结果表明，将FSCN1抑制剂NP-G2-044与TMZ联合使用，为提高TMZ疗效和克服GBM耐药性提供了一种有前景的治疗策略（图7）。

参考文献

Yang M, Niu W, Wang Y, Chen P, Mu M, Zhang X, Xu B, Hu S, Niu C, Wu P. Low YTHDC1 Expression Upregulates FSCN1 to Promote Nuclear F-Actin Formation and Facilitate Double-strand DNA Breaks Repair in TMZ-Resistant Glioblastoma. Adv Sci (Weinh). 2026 Mar;13(13):e13632. doi: 10.1002/advs.202513632. Epub 2025 Dec 27. PMID: 41454694; PMCID: PMC12955858.