NSUN2/ALYREF介导的RNA m5C修饰通过激活自噬促进前列腺癌的失巢凋亡抵抗

   前列腺癌是世界范围内男性最常见的恶性肿瘤，严重威胁着老年男性的健康。m5C修饰已被证明在各种肿瘤的发生和发展中起重要作用。然而，ALYREF在前列腺癌中的作用仍不清楚。在我们的研究中，我们发现下调ALYREF可减少前列腺癌的增殖、侵袭和转移。ALYREF通过正向调节BPIP3从而激活自噬，促进前列腺癌的失巢凋亡抵抗。在机制上，我们发现ALYREF可以直接特异性识别BNIP3 mRNA的m5C位点，增强BNIP3 mRNA的稳定性，从而激活前列腺癌细胞的自噬，从而增强癌细胞的抗肿瘤和转移能力。总之，我们的研究揭示了ALYREF介导的m5C甲基化修饰在前列腺癌自噬和失巢凋亡抵抗机制中的重要作用，为晚期前列腺癌的治疗提供了重要的分子靶点。本文于2026年3月发表于Oncogene（IF=7.3）上。

技术路线：

结果：

1）ALYREF在前列腺癌中上调，并与不良预后相关

   为了确定m5C修饰在前列腺癌中的作用，我们首先用RNA点印迹法测量了10对前列腺癌组织和配对的邻近组织中的m5C水平。我们发现前列腺癌中的m5C水平明显高于邻近组织（图1A）。随后，我们分析了TCGA数据库中498例前列腺癌组织和52例良性前列腺组织中m5C相关基因的表达。我们发现ALYREF有显著差异表达，且与生存率相关（图1B，C）。在亚组分析中，T3-T4组和淋巴结转移组的ALYREF也上调（图1D）。此外，我们发现ALYREF在前列腺癌细胞系中的表达明显高于正常前列腺上皮细胞系（图1E，F），并且其在前列腺癌组织中的表达高于邻近组织（图1G）。免疫组化进一步证实，ALYREF在转移性前列腺癌中的表达最高，其次是局限性前列腺癌，在前列腺良性组织中表达最低（图1H）。

2）体外敲低ALYREF可显著抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，提高细胞凋亡率

   为了进一步探讨ALYREF在前列腺癌中的作用，我们利用siRNA技术在PC-3和C4-2细胞系中敲低ALYREF。然后，我们进行了克隆实验和EDU增殖实验，发现ALYREF的敲低减少了菌落和增殖细胞的数量（图2A，B）。我们进行了划痕实验、室迁移和侵袭实验，发现ALYREF的敲低削弱了前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力（图2C-E）。最后，我们还进行了流式细胞术细胞凋亡实验，发现ALYREF的敲低增加了肿瘤细胞的凋亡率（图2F）。

3）体内下调ALYREF抑制前列腺癌生长和转移

   为了进一步验证ALYREF在体内的致瘤作用，我们首先建立了裸鼠皮下异种移植模型。我们观察生长曲线显示，敲低组小鼠在5周时肿瘤体积和重量明显小于对照组（图3A-C）；我们还建立了小鼠肺转移模型，小动物体内荧光成像显示，敲低组肺转移灶的荧光定量明显低于对照组（图3D）。对取出的肺组织进行类似的荧光测量（图3E）。HE染色证实，敲低组小鼠肺转移灶数量减少（图3F）。

4）NSUN2/ALYREF正调控靶基因BNIP3的表达

   为了进一步筛选ALYREF的下游靶基因，我们在敲低ALYREF后进行转录组测序，鉴定出差异基因2398个。差异基因在自噬、细胞凋亡和前列腺癌通路中富集（图4A）；我们之前的研究发现NSUN2是前列腺癌中m5C修饰的关键甲基转移酶，显著影响细胞增殖和侵袭。我们也敲低NSUN2并进行转录组测序，测序结果显示差异基因456个。差异基因主要富集于自噬、凋亡和肿瘤相关途径（图4B）。结合先前m5C亚亚酸盐测序数据，鉴定出2094个含有m5C修饰位点的基因，我们将这些基因与NSUN2和ALYREF敲低下调的基因交叉，揭示了4个常见基因：BNIP3、GPX1、TMSB10和C19ORF70（图4C）。随后，我们分别敲除NSUN2和ALYREF，BNIP3的表达最显著降低（图4D，E）。在TCGA数据库中，我们还发现NSUN2、ALYREF与BNIP3 mRNA的表达呈正相关（图4F）。上述结果初步证实BNIP3是ALYREF的下游靶基因。

5）NSUN2/ALYREF通过m5C依赖的方式调控BNIP3 mRNA的稳定性

   为了进一步验证NSUN/ALYREF通过m5C修饰调控BINP3的表达，我们进行了ALYREF-RIP qPCR。结果显示，ALYREF抗体显著富集BNIP3 mRNA，敲低NSUN2后富集能力降低（图5A）。此外，MeRIP-qPCR同样显示m5C甲基化抗体能够显著富集BINP3的mRNA，并且在敲除NSUN2后富集能力降低（图5B）。这表明ALYREF通过m5C修饰直接结合BNIP3。为了进一步验证BNIP3发生m5C甲基化的位点，我们进行了MeRIP-seq，并使用IGV软件可视化显示，片段1和片段2处出现了BNIP3 mRNA的显著富集（图5C）。我们利用RNA m5C finder数据库分别在片段1和片段2中预测了可能的修饰位点，其中C90和C207的置信度最高，分别位于5 ' UTR和CDS区域（图5D）。然后我们为这两个位点设计了特异性引物并进行了MeRIP-qPCR，结果显示NSUN2的敲低降低了m5C抗体富集C90位点的能力（引物1），而C207位点没有明显变化（引物2），这表明BNIP3 mRNA C90可能是m5C修饰发生的位点（图5E）。我们进一步进行了双荧光素酶实验，发现在5 ' UTR-WT组中，ALYREF敲除后荧光强度明显减弱，而5 ' UTR-mut组的位点没有明显变化（图5F)。此外，在CDS-MUT组和CDS-WUT组中，ALYREF敲低后的荧光强度没有明显变化，这表明ALYREF可以通过C90位点的m5C修饰结合到BNIP3 mRNA的C90位点上（图5G）。RNA稳定性分析显示，敲低NSUN2或ALYREF后，BNIP3 mRNA的稳定性显著降低（图5H）。以上充分证实了NSUN2/ALYREF通过RNA m5C修饰增强了BNIP3 mRNA的稳定性。

6）BNIP3在前列腺癌中高表达，并与前列腺癌的失巢凋亡抵抗和自噬激活相关

   我们在TCGA数据库中发现BNIP3在前列腺癌中高表达，并与T期、生化复发和无病生存相关（图6A）。此外，我们发现在GEO数据库GSE100620数据集中，BNIP3在前列腺癌耐药细胞中升高，在GSE6919数据集中，BNIP3在转移性前列腺癌中显著上调（图6B）。我们同样发现，BNIP3在前列腺癌细胞系中的表达明显高于正常前列腺上皮细胞系（图6C），其在前列腺癌组织中的表达明显高于邻近组织（图6D）。最后，免疫组织化学分析进一步证实BNIP3在转移性前列腺癌中的表达最高，其次是局限性前列腺癌，在前列腺良性组织中的表达最低（图6E）。为了进一步验证 BNIP3 在前列腺癌抗失巢凋亡中的作用，我们建立了 PC3-AR 和 C42-AR 细胞系。BNIP3 在抗失巢凋亡细胞系中显著上调（图 6F、G）。此外，我们还发现 ALYREF 蛋白和自噬标记蛋白 LC3B 在抗失巢凋亡细胞系中的表达同样上调，并且随着悬浮培养时间的延长而增加，在 24 小时达到峰值。相反，P62 蛋白的表达则随着悬浮培养时间的延长而降低（图 6H）。mRFP-GFP-LC3 自噬双荧光系统显示，抗失巢凋亡细胞中的黄色 LC3 斑点比亲代细胞多，自噬增强（图 6I）。透射电子显微镜同样显示，抗失巢凋亡细胞的自噬小泡比亲代细胞多，自噬增强（图 6J）。细胞凋亡检测显示，抗失巢凋亡细胞系的凋亡率显著低于亲代细胞，自噬抑制剂 3-MA 部分逆转了这一趋势（图 6K）。上述结果表明，BNIP3 在前列腺癌中上调，在前列腺癌抗失巢凋亡细胞中表达最高，可能通过激活自噬来调节前列腺癌细胞的抗失巢凋亡能力。

7）BNIP3通过增强自噬促进前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进失巢凋亡抵抗，受上游ALYREF 调控

   我们分别在PC-3-AR和C4-2-AR细胞系中通过siRNA和质粒转染敲低BNIP3或过表达ALYREF。我们发现，敲低BNIP3导致失巢凋亡抵抗细胞LC3B下调，P62上调，自噬水平衰减，而过表达ALYREF后自噬水平恢复（图7A）。mRFP-GFP-LC3自噬双荧光系统和透射电镜结果显示，敲低BNIP3可导致失巢凋亡抵抗细胞自噬囊泡数量减少，自噬减弱，同时过表达ALYREF后自噬水平恢复（图7B，C）。生物功能实验结果显示，敲低BNIP3可降低失巢凋亡耐受细胞的增殖活性，但加入自噬激活剂RA或过表达ALYREF后，这种作用分别被逆转（图7D–F）；同时，失巢凋亡耐受细胞的迁移和侵袭能力也受到抑制，而RA处理或ALYREF过表达同样可逆转该效应（图7G–I）。最后，凋亡实验显示，敲除BNIP3后，失巢凋亡抵抗细胞的凋亡率增加，但分别加入自噬激活剂和过表达ALYREF后，这种作用被逆转（图7J）。上述分析进一步证实了ALYREF/BNIP3通过激活自噬增强前列腺癌失巢凋亡抵抗，促进前列腺癌进展。

8）体内敲低BNIP3抑制前列腺癌的生长和转移

   为了进一步验证BNIP3在体内的促癌作用，我们首先建立了裸鼠皮下异种移植模型。我们观察生长曲线显示，敲低组小鼠在5周时肿瘤体积和重量明显小于对照组（图8A-C）；我们还建立了小鼠肺转移模型，小动物体内荧光成像显示，敲低组肺转移灶的荧光定量明显低于对照组（图8D），同样测定了取出肺组织的荧光测量（图8E），HE染色证实敲低组小鼠肺转移灶数量减少（图8F）。

结论：

   在前列腺癌中，m5C 修饰水平升高，ALYREF的表达升高，而沉默 ALYREF 可抑制前列腺癌的增殖、侵袭和转移。机制上，我们确定 BNIP3 是 NSUN2/ALYREF 介导的 m5C 修饰的功能性靶点，同时在前列腺癌抗失巢凋亡细胞系中，BNIP3 和自噬水平均升高，进一步的实验表明，ALYREF 通过识别 BNIP3 的 m5C 修饰激活自噬，从而增强前列腺癌细胞的抗失巢凋亡能力并促进前列腺癌转移。我们的研究结果表明，NSUN2/ALYREF/BNIP3 轴可能是转移性前列腺癌的有效治疗靶点。

参考文献：

Sun G, Chen S, Chen M, Xiao X, Zhang R, Ye H, Guo Y, Liu R. NSUN2/ALYREF-mediated RNA m5c modification promotes anoikis resistance of prostate cancer through activating autophagy. Oncogene. 2026 May;45(19):1800-1814. doi: 10.1038/s41388-026-03762-4.