线粒体通过上调FDX1/DLAT解偶联，使胃癌细胞对伊利司莫诱导的铜蛋白氧化更敏感

       由于肿瘤异质性和药物耐药性，胃癌的治疗仍然面临挑战。铜中毒是一种由线粒体中铜过量积累引发的新类型细胞死亡，其调控依赖于FDX1，并涉及脂酰化蛋白（如DLAT）的细胞毒性聚集。鉴于胃癌组织中铜水平显著升高，诱导铜中毒成为一种有前景的治疗策略。由于铜中毒高度依赖于活跃的线粒体呼吸作用，作者推测线粒体解偶联——通过破坏线粒体内膜上的质子梯度，将电子传递与氧化磷酸化分离，从而增强呼吸活性——可能使胃癌细胞对铜中毒更敏感。在本研究中，作者首先利用伊利司莫与铜联合处理建立胃癌细胞中的铜中毒模型，随后系统评估了线粒体解偶联对该过程的促进作用。通过使用经典的解偶联剂FCCP以及临床相关药物（尼氯胺、硝唑西汀和氧氯胺），作者证实了线粒体解偶联，表现为膜电位去极化、NAD⁺/NADH比值升高、氧气消耗增加以及ATP水平降低。重要的是，线粒体解偶联显著增强了伊利司莫-铜离子对胃癌细胞的细胞毒性作用，且该效应与DLAT寡聚化增强密切相关。机制研究发现，线粒体解偶联通过上调DLAT和FDX1蛋白表达并重塑细胞代谢，促进铜依赖性凋亡（cuproptosis）的发生。总之，本研究突出了线粒体解偶联在放大铜依赖性凋亡中的关键作用，并提出了一种基于代谢干预的新联合治疗策略。这些发现为胃癌治疗提供了新的理论基础和潜在的临床转化前景。该研究于2026年2月发表在《Free radical biology & medicine》，IF：8.0

技术路线：

主要研究结果

1. 铜离子载体诱导的胃癌细胞死亡

      胃和上小肠是人类铜吸收的主要部位。铜稳态失调是胃肠道肿瘤的公认特征，且胃癌肿瘤微环境以铜水平异常升高为特点。铜离子载体ES可与胞外铜结合并促进其向胞内转运，导致铜过载并引发后续细胞毒性作用。本研究旨在探讨ES能否利用胃癌富铜微环境来诱导细胞毒性及不可逆的细胞死亡。作者首先评估了ES（0–20 nM）在5 μM Cu²⁺共处理48 h条件下，对正常胃黏膜细胞（GES-1）和胃癌细胞（AGS及HGC27）活性的影响。在5 μM Cu²⁺存在时，5 nM ES可使AGS和HGC27细胞的活性分别降至约40%和50%。相比之下，相同剂量的ES-Cu组合对GES-1活性无显著影响（补充图1A）。基于上述结果，后续实验采用1.25、2.5和5 nM ES联合5 μM Cu²⁺，以进一步评估ES-Cu对恶性表型的影响。接下来，作者通过PI染色和LDH释放实验评估了细胞膜损伤情况。在5 μM Cu²⁺存在时，5 nM ES可诱导严重的细胞膜损伤，表现为LDH释放增加，进一步证实了细胞活性的丧失（补充图1B和C）。作者还检测了克隆形成能力、细胞迁移及上皮‑间质转化（EMT）相关蛋白的表达。与活性结果一致，ES-Cu（5 nM ES + 5 μM Cu²⁺）处理组AGS和HGC27细胞的克隆形成能力较对照组显著降低约一半（补充图1D）。同样，该处理可有效抑制细胞迁移，迁移能力降低约50%–67%（补充图1E）。此外，蛋白质免疫印迹分析显示，ES-Cu处理下调N‑钙黏蛋白和波形蛋白的表达，同时上调E‑钙黏蛋白（补充图1F），表明EMT相关蛋白表达发生逆转。总之，上述结果表明ES-Cu选择性抑制胃癌细胞的生长、克隆形成和迁移，支持其作为靶向治疗策略的潜力。

2. ES-Cu诱导胃癌细胞发生铜死亡

      既往研究已证实，铜可触发多种形式的程序性细胞死亡，包括凋亡、铁死亡和坏死性凋亡[5]。然而，在本实验中，经典细胞死亡抑制剂的预处理——包括泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK（凋亡抑制剂）、Ferrostatin-1（铁死亡抑制剂）和necrostatin-1（坏死性凋亡抑制剂）——均未能挽救ES-Cu处理后的细胞活性（补充图2A），提示ES-Cu诱导的细胞死亡通过一种不同的机制发挥作用。鉴于ES作为一种铜离子载体发挥作用，作者接下来检测了ES-Cu处理后胃癌细胞内的铜含量。在添加了5 μM Cu²⁺培养的AGS和HGC27细胞中，加入5 nM ES后，胞内铜水平从6 h开始升高，并在12、24和48 h出现显著累积（补充图2B）。这促使作者探究铜积累是否与细胞死亡直接相关。为此，作者使用了铜螯合剂四硫钼酸盐（TTM）。虽然TTM（10 μM）单独对AGS细胞表现出相当的毒性（细胞活性降至约75%），而对HGC27细胞影响较小，但它能显著减轻两种细胞系中ES-Cu诱导的细胞死亡（补充图2A）。上述结果表明ES-Cu的抗增殖作用具有铜依赖性。Tsvetkov等人近期的一项研究鉴定出一种新型铜依赖性细胞死亡通路，命名为“铜死亡”，其涉及线粒体功能障碍、三羧酸循环中断、DLAT寡聚化及Fe-S簇蛋白丢失。因此，作者假设ES-Cu主要通过铜死亡途径抑制胃癌增殖。为验证这一假设，作者首先对TCGA胃癌数据进行了基因集富集分析（GSEA），结果显示胃肿瘤生长与线粒体呼吸过程密切相关，包括有氧呼吸、电子传递链和氧化磷酸化（补充图3）。随后对ES-Cu处理48 h的HGC27细胞进行RNA-seq分析，鉴定出1384个上调和864个下调基因。功能富集分析将这些变化与未折叠蛋白反应、ATP酶活性失调、氧化磷酸化和能量稳态相关联（补充图2C），共同指向线粒体功能障碍是一个关键事件。

图1. 用FCCP或Nic处理可使胃癌细胞对ES-Cu更敏感

      作者接下来使用JC-1染色直接评估线粒体膜电位。在5 nM ES和5 μM Cu²⁺处理的AGS和HGC27细胞中，早在6–12 h即可观察到红/绿荧光比值降低（补充图2D），表明线粒体膜电位丧失先于显著的细胞活性下降（补充图4A）。这种丧失随着ES浓度增加和处理时间延长而更加明显（补充图4B），证实ES-Cu可触发早期线粒体损伤。为进一步验证铜死亡的发生，作者进行了免疫荧光和免疫印迹分析。共聚焦成像显示，ES-Cu处理细胞中DLAT与线粒体共定位，并形成DLAT聚集物（补充图2E）。蛋白质免疫印迹分析进一步表明，在5 μM Cu²⁺条件下，随着ES浓度升高（0–5 nM），不溶性DLAT蛋白水平显著增加（补充图2F），提示ES可促进铜与DLAT蛋白结合并诱导其寡聚化。与此同时，在相同处理条件下，铁硫簇蛋白LIAS、ACO2和ETFDH的表达呈浓度依赖性下调（补充图2G）。代谢物分析显示，丙酮酸和α-酮戊二酸水平升高，而琥珀酸含量降低（补充图2H）。这些综合变化证实ES-Cu处理可诱导符合铜死亡特征的代谢重编程。DLAT的脂酰化为Cu⁺诱导的寡聚化提供了分子支架。FDX1在此过程中充当核心调控因子，既促进DLAT脂酰化，又将Cu²⁺还原为Cu⁺[16]。为功能验证FDX1的作用，作者敲低了FDX1表达，并观察到ES-Cu诱导的细胞毒性显著减轻（补充图2I和J），证实FDX1在胃癌细胞铜死亡执行过程中不可或缺。

图2. 用Nic处理可增强ES-Cu诱导的胃癌细胞铜蛋白过氧化反应

3. 线粒体解偶联增强ES-Cu对胃癌细胞的细胞毒性

      Peter Tsvetkov等人（2022）报道，抑制电子传递链（ETC）复合体I和II，或抑制线粒体丙酮酸摄取，可减弱ES-Cu诱导的细胞死亡。此外，在低氧条件（1% O₂）下培养的细胞对ES-Cu的敏感性降低，而在常氧（21% O₂）条件下使用脯氨酰羟化酶抑制剂FG-4592稳定HIF通路则未能提供保护。这些发现共同强调了功能性细胞呼吸在铜死亡执行过程中的重要作用。值得注意的是，ES-Cu处理并未显著损害基础呼吸或ATP偶联呼吸，但大幅降低了呼吸储备能力，提示铜主要靶向三羧酸循环组分，而非直接损伤电子传递链[16]。因此，作者假设增强肿瘤细胞的线粒体呼吸可放大ES-Cu诱导的细胞毒性，可能为胃癌提供一种新的治疗策略。具体而言，作者提出通过线粒体解偶联进行代谢重塑可能加速呼吸通量，从而使胃癌细胞对ES-Cu更加敏感。

      为验证后续实验中选定化合物的解偶联效果，作者首先评估了它们对关键线粒体功能参数的影响。作者从经典解偶联剂FCCP开始，随后是Nic，并将研究进一步拓展至具有报道解偶联活性的驱虫药，包括Nit和Oxy。JC-1染色显示，AGS和HGC27细胞经0.25–1 μM FCCP处理24 h后，绿色荧光强度呈浓度依赖性增强，提示线粒体膜电位耗散。与解偶联一致，这同时伴随着NAD⁺/NADH比值的显著升高和细胞耗氧量的增加，以及ATP水平的明显下降，反映了氧化磷酸化解偶联的特征性表现（补充图5A和B）。类似地，0.4 μM Nic、5 μM Nit或20 μM Oxy处理同样诱导了明显的绿色荧光增强、耗氧量升高、NAD⁺/NADH比值约增加两倍以及ATP含量降低（补充图5C和D，补充图6A、B、C和D）。综上所述，这些结果证实四种化合物均能浓度依赖性地诱导线粒体解偶联，从而为后续研究它们在调控铜死亡中的作用奠定了可靠基础。

      在验证了这些药物的解偶联活性后，作者接下来将AGS、HGC27和GES-1细胞用1 μM FCCP预处理24 h，随后分别暴露于2.5 nM ES + 5 μM Cu²⁺（用于AGS）或5 nM ES + 5 μM Cu²⁺（用于HGC27和GES-1）继续处理48 h。与单独ES-Cu相比，FCCP联合处理显著降低了AGS和HGC27细胞的活性并抑制了克隆形成能力。相比之下，GES-1细胞仍具有抵抗性，除非暴露于显著更高浓度的ES-Cu（图1A）。作者进一步将此方法扩展至0.4 μM Nic预处理，同样增强了后续1.25 nM ES + 5 μM Cu²⁺对胃癌细胞活性和克隆形成的抑制作用（图1B和C）。Nit（5 μM）和Oxy（20 μM）也观察到类似效果，两者均能有效增强2.5 nM ES + 5 μM Cu²⁺对胃癌细胞的抗增殖活性，而在GES-1细胞中几乎无毒性（补充图7A、B、C和D）。这些结果与使用FCCP和Nic所得结果高度一致，表明线粒体解偶联可广泛增敏胃癌细胞对ES-Cu诱导的死亡，从而发挥选择性抗肿瘤效应。

图3. 用Nic处理可提高胃癌细胞中DLAT和FDX1蛋白的表达水平

4. 线粒体解偶联增强胃癌细胞对ES-Cu诱导铜死亡的敏感性

      为确定线粒体解偶联剂与ES-Cu联合诱导的细胞死亡是否属于铜死亡，作者首先用0.4 μM Nic预处理细胞24 h，随后与多种细胞死亡抑制剂——Z-Vad、Fer-1、Nec-1或TTM——共孵育2 h。之后将细胞暴露于1.25 nM ES和5 μM Cu²⁺处理48 h。在所测试的抑制剂中，仅TTM能显著减轻Nic–ES-Cu联合处理所引发的细胞死亡。当以5 μM Nit或20 μM Oxy替代Nic作为解偶联预处理，并采用相同的抑制剂和ES-Cu暴露方案时，获得了类似结果（图2A，补充图8A）。这些发现表明，线粒体解偶联剂联合ES-Cu诱导的细胞毒性仍具有铜依赖性，与单独ES-Cu所观察到的机制一致。为进一步确认铜死亡的发生，作者系统检测了其标志性分子事件，包括DLAT聚集和铁硫簇蛋白耗竭。免疫荧光显微镜显示，Nic联合ES-Cu处理的细胞中出现明显的DLAT寡聚化（图2B）。与此对应，蛋白质免疫印迹分析显示铁硫簇组装因子LIAS及其下游靶蛋白ACO2和ETFDH显著下调（图2C）。在ES-Cu暴露前以Nit或Oxy预处理的细胞中也观察到这些蛋白的类似耗竭（补充图8B），进一步证实这些解偶联剂可稳定诱导铜死亡相关的蛋白质稳态破坏。在功能水平上，JC-1染色显示Nic预处理显著增强了ES-Cu诱导的线粒体膜电位丧失，表现为红/绿荧光比值的明显转变（图2D）。同样，Nit和Oxy均显著加剧了ES-Cu处理后的线粒体膜电位崩溃（补充图8C和D）。综合以上数据表明，线粒体解偶联通过协同机制放大ES-Cu诱导的铜死亡：促进DLAT寡聚化、加速铁硫簇蛋白降解，并加剧线粒体功能障碍。

5. 线粒体解偶联建立有利于铜死亡发生的环境

      铜死亡的诱导依赖于FDX1介导的Cu²⁺还原为Cu⁺，随后由Cu⁺触发DLAT寡聚化。已知线粒体解偶联可增强电子传递链活性并促进三羧酸循环的代谢通量。鉴于DLAT作为PDH复合物的核心结构组分，其表达可能与线粒体代谢状态密切相关。因此，作者假设线粒体解偶联通过改变线粒体的呼吸状态并影响这些关键调控节点，从而调节细胞对铜死亡的敏感性。为验证这一假设，作者首先用Nic（0–0.4 μM）处理胃癌细胞24 h，观察到DLAT蛋白表达呈剂量依赖性上调（图3A）。由于DLAT是PDH复合物的必需亚基，其累积可能反映PDH活性的增强。与此一致，酶活性测定证实Nic处理后PDH活性升高（图3B），表明DLAT累积和PDH激活均代表细胞对解偶联诱导的代谢重塑所产生的适应性反应。为评估该现象的普遍性，作者进一步检测了Nit（0–20 μM）和Oxy（0–40 μM）。两种药物同样诱导DLAT表达的剂量依赖性升高，并增强了PDH活性（补充图9A和B，补充图9D和E），提示所观察到的调控代表了一种在不同化学结构的线粒体解偶联剂之间共有的机制。

      此外，FDX1——铜死亡过程中负责将Cu²⁺还原为更具反应活性的Cu⁺的关键还原酶在Nic、Nit和Oxy处理后也显著上调（图3C，补充图9C，补充图9F）。这些结果支持线粒体解偶联通过协同上调细胞死亡通路中多个关键组分来增强铜死亡的观点。综上所述，线粒体解偶联通过协同增强PDH活性、促进DLAT累积和上调FDX1表达，建立了一种有利于铜死亡执行的代谢环境。这种重塑后的代谢环境有利于Cu⁺与DLAT结合及随后的寡聚化，加剧了铜诱导的蛋白质毒性应激，并最终放大铜死亡级联反应。

图4. 肿瘤体内实验表明，Nic干预显著增强了ES-Cu抑制胃癌细胞的能力

6. 线粒体解偶联在体内增强ES-Cu对胃癌细胞的毒性

      作者上述研究结果表明，线粒体解偶联可增强线粒体呼吸，从而增加胃癌细胞对铜离子载体ES介导铜死亡的敏感性。为探索潜在的临床应用价值，作者采用安全性高的线粒体解偶联剂Nic进行体内研究（图4A）。在ES-Cu单药治疗组中，与对照组相比，作者观察到胃癌生长受到适度但显著的抑制，证实了ES-Cu的抗肿瘤疗效。同样，Nic单独给药（10或20 mg/kg）可剂量依赖性地抑制胃癌进展。值得注意的是，当Nic（10 mg/kg）与ES-Cu联合使用时，肿瘤抑制作用显著增强，表现为肿瘤体积和重量的明显减小。较高剂量的Nic（20 mg/kg）进一步增强该协同效应（图4B、C和D）。后续分析显示，Nic诱导的线粒体解偶联（10和20 mg/kg）联合ES-Cu治疗可显著抑制增殖标志物Ki67的表达。此外，作者检测到铁硫簇蛋白（LIAS、ACO2和ETFDH）显著下调，这些蛋白可作为铜依赖性细胞死亡的分子标志物（图4F）。重要的是，所有治疗方案均耐受性良好，裸鼠体重无明显变化。H&E染色证实重要器官的组织结构保持正常。对各组心脏、肝脏、脾脏和肾脏切片的系统检查显示，各组均呈现完整的心肌纤维、完好的肝索结构、完整的肾小球和肾小管，以及分界清晰的白髓和红髓。所有治疗组均未观察到坏死、炎性浸润、纤维化或异常细胞肥大等病理改变或药物中毒迹象（图4E和G）。上述发现共同表明，药理诱导的线粒体解偶联可有效促进胃癌细胞发生铜死亡，这代表了一种有前景的胃癌治疗策略。Nic的剂量依赖性效应及其与ES-Cu的协同相互作用，为优化联合治疗方案提供了有价值的参考依据。

结论

      本研究表明，线粒体解偶联可增强ES诱导的铜死亡，从而通过协同机制抑制胃癌细胞的恶性生物学行为。具体而言，ES在胃癌细胞中触发铜依赖性细胞死亡程序，有效抑制肿瘤细胞增殖和活性。此外，作者证明线粒体解偶联显著提高胃癌细胞对铜死亡的敏感性。在所筛选的多种药物中，被鉴定为线粒体解偶联剂的驱虫药如Nic、Nit或Oxy，被证实可通过诱导线粒体解偶联来增强癌细胞对铜死亡的敏感性。在机制上，线粒体解偶联可上调DLAT和FDX1的表达，从而营造一种更有利于铜死亡发生的代谢环境。这些发现为开发基于铜死亡诱导和线粒体代谢调节的新型胃癌联合疗法提供了重要的理论基础和潜在的临床转化途径。尽管本研究确立了线粒体解偶联对DLAT和FDX1表达的调控作用，但控制其上调的精确分子机制仍有待进一步探究。

参考文献

Lu Y, Li Y, Sun X, Li X, Zhao S, Fang Y, Qiu W, Luo C, Qi W. Mitochondrial uncoupling sensitizes gastric cancer cells to elesclomol-induced cuproptosis via FDX1/DLAT upregulation. Free Radic Biol Med. 2026 Feb 16;244:284-295. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2025.12.019. Epub 2025 Dec 15. PMID: 41407052.