CRISPR文库筛选服务

CRISPR文库筛选服务

CRISPR文库筛选是一种基于CRISPR-Cas9基因编辑系统的大规模功能基因筛选技术，通过构建包含大量靶向不同基因sgRNA的混合文库，在细胞群体中并行敲除/激活/抑制成千上万个基因，通过压力（药物筛选、流式分选等）筛选并结合高通量测序，系统性筛选调控特定生物学表型的关键基因。

图1 CRISPR文库筛选示意图

CRISPR文库筛选步骤

1、选择合适的细胞模型：细胞要具有一定的传代能力，并能承受筛选条件（如化合物、低氧等），可稳定表达Cas9或dCas9（用于敲除/激活/干扰）。

2、文库构建与包装：构建全基因组或通路特异文库质粒，并包装为慢病毒，保证高质量、低偏差传递到细胞。

3、文库感染与建库：低MOI感染细胞，保证每个细胞仅携带一个sgRNA。

4、施加筛选压力选择：对感染文库的细胞施加特定条件（如化合物处理、传代、流式分选），设定处理组与对照组，进行富集筛选。

5、基因组DNA提取与NGS测序：提取细胞基因组DNA，扩增sgRNA条码区，进行高通量测序。

6、生物信息分析与候选基因筛选：使用MAGeCK、edgeR等分析工具识别富集/耗竭的sgRNA，筛选候选关键基因。

CRISPR文库筛选应用案例

1、肿瘤免疫调控研究

T细胞通过T细胞受体（TCR）识别癌症新生抗原，结合癌细胞后通过释放颗粒酶和穿孔素，诱导癌细胞凋亡。Akana^[1]等在人原代CD8⁺ T细胞过表达一种具有临床活性的TCR，该TCR可识别A375黑色素瘤细胞表达的NY-ESO-1抗原；然后构建了一个包含32,670条sgRNA的文库，靶向2,919个基因（每个基因10个sgRNA）以及560个非靶向对照gRNA。CRISPR文库转染稳定表达CRISPR–dCas9-VPR的A375细胞，并将黑色素瘤细胞与来自同一供体的NY-ESO-1 TCR细胞或野生型T细胞进行三轮共培养。最终筛选鉴定出多种功能的TCR特异性细胞毒性调节因子，包括SAFB、KHDRBS1、MYC、CD44、WNT3A、WNT1等。

图2 TCR特异性细胞毒性调节因子CRISPR激活文库筛选流程图^[1]

图3 CRISPRa筛选结果火山图^[1]

2、肿瘤基因功能研究

为鉴定与肿瘤免疫逃逸相关的代谢基因，Yuan等^[2]向表达Cas9和卵清蛋白（OVA）的B16F10（B16-OVA）黑色素瘤细胞中转染了靶向3,017个代谢相关基因的单gRNA文库，并在T细胞介导的免疫压力条件下进行了CRISPR敲除筛选19（图1a）。在体外和体内响应免疫压力的肿瘤细胞中，靶向Vdac2的sgRNA属于耗竭最显著的sgRNA之一（图1b,c），提示其在肿瘤免疫逃逸中发挥作用。研究人员进一步将靶向19,674个基因的全基因组sg文库转染到B16-OVA-sg Vdac2细胞中，通过遗传相互作用筛选，确定BAK是介导VDAC2缺陷所引起效应的关键分子（图）。

图4 肿瘤免疫逃逸相关代谢基因CRISPR筛选^[2]

图5 BAK介导VDAC2缺陷驱动的IFNγ应答效应^[2]

3、耐药基因筛选研究

Vemurafenib是突变的蛋白激酶BRAF的抑制剂，对存在V600E BRAF突变的黑色素瘤有治疗效果。Shalem等^[3]设计了靶向全基因组GeCKO敲除文库（靶向18080个基因，包含64751条sgRNA），并将GeCKO文库转染进携带BRAF突变的黑色素瘤细胞A375中。通过加入Vemurafenib筛选具有药物抗性的细胞，对这部分细胞进行高通量测序，筛选出NF1、MED12、NF2、CUL3、TADA2B、TADA1等敲除后能使细胞对Vemurafenib产生抗性的基因。

图6 GeCKO文库的设计及其在全基因组负向选择筛选中的应用^[3]

4、糖尿病β细胞proinsulin调控基因研究

β细胞和血液中前胰岛素（proinsulin）水平的改变是糖尿病及其他疾病的标志性特征，但对proinsulin调节因子的了解仍然有限。在此，Lai等[4]通过全基因组CRISPR筛选，鉴定出84种能改变小鼠β细胞系内proinsulin/insulin比值的proinsulin调节因子。这些proinsulin调节因子与先前通过正交CRISPR筛选获得的胰岛素调节因子不同。对这些proinsulin调节因子的功能注释表明，高尔基体是proinsulin储存和调节的主要细胞器。向高尔基体的转运会增加细胞内proinsulin与insulin的比值，而远离高尔基体的转运（包括胞吐作用和高尔基体至内质网的逆向转运）则会降低细胞内proinsulin水平。

图7 proinsulin调节因子全基因组CRISPR筛选^[4]

参考文献

1、Akana RV, Yoe J, Laveroni O, Sun C, Kim YM, Jerby L. High-content CRISPR activation screens identify synthetically lethal RNA-based mechanisms to sensitize cancer cells to targeted T cell cytotoxicity. Nat Genet. 2026;58(4):841-853. IF: 25.5 Q1

2、Yuan S, Sun R, Shi H, et al. VDAC2 loss elicits tumour destruction and inflammation for cancer therapy. Nature. 2025;640(8060):1062-1071. IF: 56.1 Q1

3、Shalem O, Sanjana NE, Hartenian E, et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 2014;343(6166):84-87. IF: 47.3 Q1

4、Lai S, Keller MP, Zhang J, et al. Proinsulin regulators identified with CRISPR screen and in vivo mouse QTL mapping. Nat Commun. 2026;17(1):5159. Published 2026 Apr 13. IF: 18.1 Q1