癌细胞也会“主动逃跑”？VIPAS39介导ACSL4外排揭示卵巢癌铁死亡耐受新机制

       卵巢癌是女性生殖系统中恶性程度最高的肿瘤之一，由于早期症状隐匿，大多数患者确诊时已经处于晚期阶段。尽管手术联合铂类化疗能够在初期获得较好的治疗效果，但肿瘤复发和化疗耐药仍然是影响患者长期生存的主要难题。

      近年来，随着肿瘤细胞死亡方式研究的不断深入，一种区别于传统凋亡、坏死和自噬的新型程序性细胞死亡方式——铁死亡（ferroptosis）逐渐成为抗肿瘤治疗研究的热点。铁死亡主要表现为铁依赖性的脂质过氧化物积累，最终导致细胞膜损伤和死亡。由于肿瘤细胞通常具有更高的铁需求以及活跃的脂质代谢特点，因此其理论上更容易受到铁死亡攻击，这也为开发新的抗癌策略提供了重要方向。然而，一个关键问题仍然存在：为什么部分癌细胞能够逃避铁死亡？

      此前研究发现，促铁死亡蛋白ACSL4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4）是决定细胞铁死亡敏感性的重要因素。ACSL4能够促进多不饱和脂肪酸（PUFA）进入细胞膜磷脂结构，为脂质过氧化提供底物，从而推动铁死亡发生。研究人员进一步发现，天然因素 IFN-γ（干扰素γ）联合花生四烯酸（arachidonic acid，AA）可以通过ACSL4依赖方式诱导多种肿瘤细胞发生铁死亡。然而，在上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）中，部分细胞却表现出了明显的铁死亡抵抗能力，其背后的分子机制尚未明确。

       在本研究中，研究团队发现：铁死亡耐受型卵巢癌细胞并不是简单降低ACSL4表达，而是通过外泌体（exosome）主动将ACSL4蛋白排出细胞外，从而降低细胞内促铁死亡信号。进一步研究发现，囊泡运输相关蛋白VIPAS39 是这一过程中的关键调控因子，它能够促进ACSL4进入晚期内体，并通过外泌体途径完成释放。阻断VIPAS39功能后，可以恢复细胞内ACSL4水平，提高卵巢癌细胞对铁死亡的敏感性，并抑制肿瘤生长。该研究揭示了一种此前未被认识的铁死亡逃逸机制：癌细胞通过“丢弃”促死亡蛋白ACSL4，实现对铁死亡攻击的主动防御。这一发现不仅深化了对肿瘤铁死亡调控机制的理解，也为开发靶向VIPAS39、增强铁死亡治疗效果的新策略提供了潜在方向。

技术路线：

本文于2025年3月发表在《EBiomedicine》IF：11杂志上。

主要实验结果：

1.不同卵巢癌细胞对铁死亡诱导表现出不同敏感性

      为了探究卵巢癌细胞对铁死亡的响应情况，研究团队选取了5种上皮性卵巢癌（EOC）细胞系，包括A2780、SKOV3、OVCAR3、OVCAR8和CAOV3，并利用天然铁死亡诱导因素IFN-γ联合花生四烯酸（AA）进行处理（图1A）。结果发现，不同卵巢癌细胞对该刺激表现出明显不同的反应。其中，A2780、OVCAR3和OVCAR8细胞在处理后出现明显的细胞死亡，而SKOV3和CAOV3细胞的细胞形态基本没有明显变化，提示部分卵巢癌细胞能够抵抗IFN-γ+AA诱导的细胞死亡（图1A）。为了进一步验证这种差异，研究人员通过CCK-8实验检测不同时间点细胞存活情况（图1B）。结果显示，在IFN-γ+AA刺激下，A2780、OVCAR3和OVCAR8细胞的死亡比例随着处理时间延长持续增加，到第4天时细胞死亡率超过50%；相比之下，SKOV3和CAOV3细胞在不同时间以及不同剂量刺激条件下，细胞活力均未出现明显下降（图1B）。因此，研究团队将A2780、OVCAR3和OVCAR8定义为铁死亡敏感细胞，而SKOV3和CAOV3则被认为是铁死亡耐受细胞。随后，为明确IFN-γ+AA诱导的细胞死亡类型，研究人员分别加入铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）、坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1（Nec-1）以及凋亡抑制剂Z-VAD-FMK进行验证（图1C）。结果发现，仅Fer-1能够明显挽救细胞死亡，而Nec-1和Z-VAD-FMK并不能产生保护作用，说明IFN-γ联合AA主要诱导的是铁死亡，而非传统的凋亡或坏死性凋亡过程（图1C）。研究人员进一步利用C11-BODIPY探针检测细胞内氧化脂质积累情况（图1D-E）。结果显示，在IFN-γ+AA刺激后，铁死亡敏感细胞A2780、OVCAR3和OVCAR8出现明显的脂质氧化增加，而SKOV3和CAOV3细胞则没有明显变化（图1D-E）。与此同时，MDA检测结果也显示，敏感细胞中脂质过氧化产物MDA水平显著升高，而耐受细胞未出现明显升高（图1F），进一步证明不同卵巢癌细胞对于铁死亡压力具有不同的应答能力。此外，研究人员利用透射电子显微镜观察铁死亡过程中细胞器变化。结果发现，铁死亡敏感细胞在IFN-γ+AA处理后出现典型的线粒体损伤特征，包括线粒体体积缩小、膜密度增加以及线粒体嵴减少，而铁死亡耐受细胞并未出现明显线粒体异常（图1G）。

图1：不同卵巢癌细胞对IFN-γ联合AA诱导的铁死亡表现出不同敏感性

2.铁死亡耐受型卵巢癌细胞通过外泌体排出ACSL4，降低细胞铁死亡敏感性

      研究人员首先检测不同卵巢癌细胞在IFN-γ和AA处理后的ACSL4表达变化（图2A-B）。结果发现，在IFN-γ刺激下，不同细胞中的ACSL4蛋白均有所升高，说明IFN-γ能够促进ACSL4表达。然而，当进一步加入AA后，铁死亡敏感细胞A2780、OVCAR3和OVCAR8中的ACSL4水平基本保持稳定，而铁死亡耐受细胞SKOV3和CAOV3中的ACSL4蛋白水平却明显下降（图2A-B）。为了明确ACSL4下降是否来源于转录调控，研究人员进一步检测ACSL4 mRNA水平（图2C）。结果显示，无论是IFN-γ单独处理，还是IFN-γ联合AA处理，ACSL4基因转录水平并未发生明显变化（图2C）。随后，研究人员进一步探索ACSL4蛋白减少是否由于细胞内降解增强导致（图2D-E）。通过使用蛋白合成抑制剂CHX、蛋白酶体抑制剂Bortezomib以及溶酶体抑制剂Bafilomycin A1进行实验后发现，阻断蛋白酶体或溶酶体降解途径均无法恢复ACSL4蛋白水平（图2D-E）。研究人员进一步检测细胞培养液中的ACSL4含量（图2F-G）。结果发现，在IFN-γ+AA刺激后，铁死亡耐受细胞SKOV3和CAOV3释放到胞外环境中的ACSL4明显增加（图2F-G）。进一步对细胞外囊泡进行分离鉴定发现，ACSL4主要存在于外泌体（exosome）中，而不是微囊泡（microvesicle）中（图2H-K）。为了进一步验证ACSL4是否进入外泌体形成相关结构，研究人员检测了ACSL4与外泌体标志蛋白CD63之间的关系（图2L-M）。结果显示，在AA刺激后，ACSL4与CD63的共定位明显增强，说明ACSL4能够进入晚期内体相关结构，并通过外泌体途径完成释放（图2L-M）。

图2：铁死亡耐受型卵巢癌细胞通过外泌体途径输出ACSL4

3.ACSL4通过多泡体（MVB）-外泌体途径动态运输并释放到细胞外

      为了实时观察ACSL4在细胞内的运输过程，研究人员构建了ACSL4荧光标记系统，并利用活细胞成像技术追踪ACSL4的位置变化（图3A）。结果发现，在未受到刺激时，ACSL4主要分布于细胞质区域；而在AA刺激后，ACSL4逐渐向细胞内囊泡结构聚集，并最终形成明显的胞内颗粒信号（图3A）。随后，研究人员进一步检测ACSL4与多泡体（multivesicular body，MVB）标志结构之间的关系（图3B-C）。多泡体是外泌体形成的重要中间结构，细胞内蛋白可以通过进入MVB内部的小囊泡，最终随着MVB与细胞膜融合释放形成外泌体。实验结果显示，AA处理后，ACSL4与MVB相关标志物的共定位明显增加（图3B-C），说明ACSL4能够被运输至外泌体形成相关区域。进一步通过时间动态观察发现，ACSL4进入囊泡结构后，随着时间推移逐渐向细胞外围移动，并最终释放到细胞外环境中（图3D-E）。为了验证这一过程是否依赖外泌体释放机制，研究人员进一步对外泌体分泌过程进行干预。结果显示，当外泌体释放受到抑制时，细胞外ACSL4水平明显降低，而细胞内ACSL4含量得到恢复（图3F-G），说明ACSL4的减少确实依赖于外泌体介导的输出过程。

图3：ACSL4通过多泡体（MVB）-外泌体途径实现细胞外输出的可视化分析

4.通过蛋白质组学筛选ACSL4外泌体输出的关键互作蛋白

      为了寻找参与ACSL4外泌体分选过程的关键调控蛋白，研究人员在表达Flag-ACSL4的CAOV3细胞中进行了免疫亲和纯化结合LC-MS/MS质谱分析，以筛选能够与ACSL4相互作用的蛋白（图4A）。首先，研究人员通过Western blot验证Flag标记ACSL4蛋白的表达情况以及免疫沉淀（IP）实验效率（图4B-C），确认后续蛋白质组学分析的可靠性。随后，研究人员对ACSL4互作蛋白进行蛋白质组学鉴定。结果显示，在铁死亡压力条件下，不同重复实验中ACSL4互作蛋白筛选结果具有较高一致性，其中IgG对照组和Flag-IP组的相关系数分别达到0.814和0.910（图4D），说明该筛选体系具有较好的重复性。通过严格筛选标准，研究人员共鉴定获得693个满足条件的蛋白质，进一步比较Flag-IP组与对照组蛋白丰度差异后，研究人员筛选出210个在Flag-IP组中富集的蛋白（图4D）。随后，以蛋白富集倍数（fold change）≥2以及差异分析p值＜0.05作为筛选标准，研究人员最终获得60个可能与ACSL4相互作用的候选蛋白，其中包括EIF3M、PRRC2B、VIPAS39、LARP4B、EIF3L以及PANK1等蛋白（图4E-F）。为了进一步分析这些候选蛋白的生物学功能，研究人员进行了功能富集分析。结果发现，这些ACSL4互作蛋白主要参与蛋白运输、内体结构、囊泡介导运输、囊泡连接复合体以及细胞骨架相关过程（图4G）。这些结果提示，ACSL4的外泌体输出可能受到细胞内囊泡运输系统调控。进一步结合内体结构以及囊泡介导蛋白运输相关功能，研究人员筛选出5个最可能参与ACSL4外泌体分选过程的候选蛋白，包括VIPAS39、VPS33B、USP10、PANK1和AP2B1（图4H）。

图4：筛选参与ACSL4外泌体输出的候选互作蛋白

5.VIPAS39特异性结合ACSL4并调控其外泌体输出

       首先，研究人员利用免疫共沉淀（Co-IP）实验检测ACSL4与5个候选蛋白之间的相互作用关系。结果显示，在这5个候选蛋白中，仅有VIPAS39能够与ACSL4发生共沉淀，而VPS33B、USP10、PANK1和AP2B1均未检测到与ACSL4的明显相互作用（图5A）。这一结果表明，VIPAS39可能是ACSL4外泌体输出过程中的特异性互作蛋白。随后，研究人员进一步利用原位近距离连接分析（PLA）验证ACSL4与VIPAS39在细胞内的相互作用情况。结果显示，在铁死亡诱导条件下，细胞内出现明显的PLA阳性信号，进一步证明VIPAS39与ACSL4能够在细胞环境中发生特异性结合（图5B）。为了进一步定量分析两者之间的结合能力，研究人员采用微量热泳动技术（MST）检测VIPAS39与ACSL4之间的结合亲和力。结果显示，VIPAS39与ACSL4之间具有较强结合能力，其解离常数（Kd）为1.62μM（图5C），说明二者之间存在稳定的蛋白互作关系。此外，研究人员通过GST pull-down实验进一步验证两者是否存在直接结合关系。实验结果显示，VIPAS39能够直接结合ACSL4，进一步确认了VIPAS39与ACSL4之间的直接相互作用（图5D）。为了进一步验证VIPAS39是否真正参与ACSL4的外泌体输出过程，研究人员在铁死亡耐受型卵巢癌细胞中敲低VIPAS39，并检测细胞内外ACSL4蛋白水平变化，结果显示，在IFN-γ联合AA刺激条件下，VIPAS39敲低后，两种铁死亡耐受细胞中细胞内ACSL4蛋白水平明显升高，而细胞外环境中的ACSL4含量显著降低，而重新表达VIPAS39后，这种ACSL4在细胞内外分布的变化得到恢复（图5E-F）。这些结果表明，VIPAS39能够促进ACSL4从细胞内部向细胞外运输，是ACSL4外排过程中的关键调控因子。随后，为进一步明确VIPAS39介导的ACSL4运输是否依赖多泡体（MVB）-外泌体途径，研究人员在表达ACSL4-EGFP的CAOV3细胞中，利用免疫荧光观察VIPAS39、ACSL4以及外泌体相关标志蛋白CD63的亚细胞定位变化，结果发现，与对照组相比，AA处理后ACSL4与VIPAS39以及CD63之间的共定位明显增强（图5G），提示铁死亡刺激促进ACSL4进入VIPAS39相关的囊泡运输结构。同时，AA处理进一步增强了VIPAS39与CD63之间的共定位，而敲低VIPAS39后，ACSL4与CD63的共定位明显降低（图5G）。为了进一步验证VIPAS39对铁死亡敏感性的影响，研究人员在VIPAS39敲低的铁死亡耐受细胞中进行脂质氧化检测以及线粒体超微结构分析，结果显示，与对照组相比，VIPAS39缺失后，细胞脂质过氧化水平明显升高，同时出现铁死亡相关的线粒体形态改变（图5H-K）。

       最后，研究人员进一步分析VIPAS39表达水平与卵巢癌患者预后的关系（图5L），通过两个卵巢癌患者队列进行Kaplan-Meier生存分析发现，VIPAS39高表达患者的总体预后明显差于低表达患者（图5L）。这一结果提示，高水平VIPAS39可能通过抑制治疗诱导的肿瘤细胞死亡促进疾病进展，同时也说明VIPAS39可能具有潜在治疗靶点价值。

图5：VIPAS39促进ACSL4外排，降低细胞内ACSL4水平并介导铁死亡抵抗

6.抑制VIPAS39增强铁死亡治疗效果并克服卵巢癌铁死亡耐受

      首先，研究人员利用CAOV3细胞构建皮下移植瘤（CDX）模型，评估抑制VIPAS39联合铁死亡诱导治疗的效果（图6A-B）。实验中，将CAOV3细胞接种于裸鼠皮下，当肿瘤体积达到约100 mm³后，给予IFN-γ和AA处理，并结合shVIPAS39抑制VIPAS39表达。结果显示，在27天观察期间，与单独铁死亡诱导治疗相比，联合抑制VIPAS39能够更加明显地抑制肿瘤生长，肿瘤进展速度显著降低（图6A-B）。随后，研究人员进一步检测治疗后肿瘤组织中的铁死亡水平变化（图6C-D）。结果发现，与单独铁死亡诱导治疗相比，shVIPAS39联合IFN-γ+AA处理能够显著增加铁死亡标志物4-HNE的表达水平（图6C），提示脂质过氧化水平进一步增强。同时，该联合治疗并未明显影响凋亡水平（图6D），说明VIPAS39抑制主要增强了铁死亡相关杀伤作用。为了进一步验证VIPAS39表达水平与铁死亡敏感性的关系，研究人员分析了两组临床晚期且对传统治疗耐受的卵巢癌患者样本（图6E-F）。首先，研究人员分离并培养两名患者来源的原代肿瘤细胞，并检测VIPAS39蛋白表达水平，结果显示，患者1来源肿瘤细胞中VIPAS39表达水平明显高于患者2来源细胞（图6E）。随后，研究人员比较不同VIPAS39表达水平肿瘤细胞对于IFN-γ+AA诱导铁死亡的响应情况，结果发现，VIPAS39低表达肿瘤细胞在IFN-γ+AA处理后细胞活力下降更加明显，而VIPAS39高表达细胞表现出更强的铁死亡抵抗能力（图6F）。这一结果进一步支持VIPAS39表达水平与卵巢癌铁死亡耐受能力相关。进一步地，研究人员利用患者来源异种移植模型（PDX）验证靶向VIPAS39的治疗效果，研究人员将VIPAS39高表达患者来源的原代肿瘤细胞移植至裸鼠体内，并给予铁死亡诱导治疗联合shVIPAS39处理。结果显示，与单独铁死亡诱导治疗相比，抑制VIPAS39后肿瘤生长速度明显减慢，同时肿瘤组织中铁死亡标志物水平升高（图6G-J），这一结果与CDX模型中的观察结果一致。

图6：抑制VIPAS39增强铁死亡治疗效果并抑制卵巢癌体内生长

       综上所述，本研究揭示了一种新的卵巢癌铁死亡逃逸机制：卵巢癌细胞还可以通过一种更加主动的方式——直接清除促铁死亡蛋白ACSL4。具体机制如下：IFN-γ+AA刺激→铁死亡压力增加→VIPAS39识别ACSL4 →促进ACSL4进入晚期内体并包装进入外泌体→ACSL4被释放到细胞外→细胞内脂质过氧化降低→卵巢癌细胞获得铁死亡耐受。研究进一步证明，靶向VIPAS39能够阻断这一逃逸过程，使肿瘤细胞重新恢复铁死亡敏感性，为卵巢癌治疗提供了新的潜在靶点。

参考文献：

Jiang Y, Li J, Wang T, Gu X, Li X, Liu Z, Yue W, Li M. VIPAS39 confers ferroptosis resistance in epithelial ovarian cancer through exporting ACSL4. EBioMedicine. 2025 Apr;114:105646. doi: 10.1016/j.ebiom.2025.105646. Epub 2025 Mar 14. PMID: 40088627; PMCID: PMC11957506.