NKD1通过Wnt/β-catenin信号通路促进结直肠癌的进展和5-FU耐药

 5-氟尿嘧啶（5-FU）耐药性仍然是晚期结直肠癌（CRC）术后治疗的一个相当大的障碍。本研究基于GEO和TCGA数据库的测序数据，发现NKD1是CRC中5-FU耐药的关键因素。NKD1表达升高与不良的临床病理特征和较差的患者生存相关。功能分析显示，NKD1过表达提高了5-FU的IC50，促进了肿瘤细胞的增殖，并减轻了药物治疗和未治疗组的细胞凋亡。此外，NKD1促进结直肠癌细胞迁移和侵袭，调节肿瘤干细胞标记物。在机制上，NKD1稳定DVL蛋白，调节APC和FZD7，促进β-catenin的核积累，启动Wnt信号下游的转录程序。沉默NKD1与5-FU协同提高患者源性类器官和异种移植模型的治疗效果。这些结果表明，NKD1是通过Wnt/β-catenin通路激活的结直肠癌恶性肿瘤和化疗耐药的关键调节因子，支持其作为双重生物标志物和联合治疗方案的治疗靶点的潜力。本文于2026年7月发表于Cell Death and Disease（IF=12.2）上。

技术路线：

结果：

1）NKD1的表达及其临床意义

GEO（比较5-FU抗性和亲本细胞系）和GDSC数据库的综合分析确定了6个与5-FU抗性相关的候选基因，包括NKD1（图1A）。通过TCGA和Gtex进行的泛癌分析显示，NKD1在结直肠癌和低级别胶质瘤中的表达升高（图1B）。TCGA数据的进一步分析证实，NKD1在结直肠癌组织中的表达明显更高（图1C，D）。具体而言，NKD1在IV期患者中的表达高于I期和II期（图1E），高表达组的总生存率（OS）明显低于低表达组（图1F，G）。为了验证这些发现，qRTPCR和western blotting显示，NKD1在结直肠癌组织和细胞系中的表达增加（图1H，I）。免疫组化结果显示，NKD1主要定位于细胞核和细胞质中（图1J），且NKD1在结直肠癌组织中的表达水平明显高于邻近正常组织。组织芯片分析显示，NKD1表达与T（图1K）、N、肿瘤分化和UICC分期（图1L）相关。这些数据表明，NKD1可能是一个关键的致癌因子，并具有作为CRC诊断和治疗靶点的潜力。

2）NKD1在体外促进结直肠癌细胞的恶性增殖和抑制凋亡

为了阐明NKD1在结直肠癌中的功能作用，使用siRNA介导的敲低和质粒驱动的过表达构建体（si-NKD1, e -NKD1）来调节表达，使用qRT-PCR和western blotting证实转染效率。包括集落形成、CCK-8和EdU染色在内的功能分析显示，沉默NKD1可显著抑制HCT8和HCT15细胞的增殖能力（图2A-C），而强制表达NKD1可显著增强HCT116细胞的增殖能力（图2D-F）。凋亡实验显示，NKD1下调促进HCT8和HCT15细胞的凋亡（图2G），而NKD1上调抑制HCT116细胞的凋亡(图2H)。在HCT8和HCT15细胞中，与si-NC组相比，NKD1敲低显著增加了Bax和Cleaved-caspase3的表达，降低了PCNA和Bcl2的水平（图2I）。相反，当NKD1过表达时，观察到相反的现象（图2J）。

3）NKD1促进结直肠细胞的体外迁移和侵袭，促进体内增殖

NKD1也调节转移表型。在伤口愈合和Transwell实验中，它的缺失会损害细胞的迁移和侵袭，而过表达会增强这些能力（图3A-D）。此外，NKD1敲低可增加上皮标志物E-cadherin，降低间质标志物N-cadherin和Snail，这与抑制上皮-间质转化（EMT）一致；同样，过表达具有相反的效果（图3E，F）。接下来，我们利用裸鼠皮下异种移植模型评估了NKD1在肿瘤生长中的作用。与体外实验数据一致，HCT8细胞中的NKD1敲低（shNKD1）显著抑制肿瘤生长，导致肿瘤比sh-NC对照组更小、更轻。相反，NKD1过表达（OE-NKD1）在HCT116细胞中加速肿瘤生长，产生比载体对照更大的肿瘤（图3G-I）。肿瘤切片的免疫组化染色证实，NKD1的下调降低了NKD1、Ki-67和Bcl-2的表达，而NKD1的过表达导致了它们的上调（图3J）。因此，NKD1是体内结直肠癌肿瘤生长的有效驱动因子。

4）NKD1通过减少CRC细胞凋亡促进5-FU耐药

为了评估NKD1表达与药物反应的关系，我们分析了GDSC数据库中的基因表达和药物敏感性谱。Pearson相关性显示NKD1水平与5-FU耐药性呈正相关（图4A）。为了探索NKD1对5-FU治疗的影响，我们通过长时间暴露于低浓度的5-FU培养了一株抗5-FU的HCT8细胞系（HCT8R）。IC50测定证实了耐药性，与亲代HCT8细胞（6.89 μg/mL）相比，HCT8R细胞的IC50显著升高（18.29 μg/mL）（图4B）。这些结果证实了HCT8细胞中5-FU耐药性的成功建立。qRT-PCR和western blot分析显示，HCT8R细胞中NKD1的表达较高（图4C，D）。功能增益和功能丧失实验证实了NKD1在调节5-FU反应中的直接作用。在亲代HCT8细胞中过表达NKD1会增加IC50，而在HCT8R细胞中沉默NKD1会使它们致敏，降低IC50（图4E，F）。此外，即使在没有5-FU的情况下，耐药细胞中的NKD1敲低也会减少集落的形成和迁移，并增加凋亡（图4G，I，K）。此外，NKD1敲低HCT8-5FU-R细胞恢复其对5-FU的敏感性。NKD1在敏感细胞中的过表达促进了集落的形成和迁移，抑制了细胞凋亡（图4H，J，L）。总的来说，这些发现表明NKD1有助于CRC细胞对5-FU的耐药性。

5）NKD1维持结直肠癌细胞的干性

鉴于化疗耐药是癌症干细胞（CSCs）的标志，我们研究了NKD1是否影响结直肠癌细胞的干细胞性。TCGA CRC数据分析显示，NKD1转录物水平与已建立的CSC标记物SOX2、DPP4、CD166和LGR5呈正相关（图5A）。在功能上，NKD1敲低会损害球体形成能力，而过表达则会增强球体形成能力（图5B）。在分子水平上，干性标志物CD44、SOX2和LGR5的蛋白表达与NKD1水平呈正相关；敲除降低了它们的表达，过表达则增加了它们的表达（图5C，D）。这些发现表明NKD1在维持肿瘤细胞的干性中起着关键作用。在异种移植小鼠模型中检测了NKD1对5-FU耐药性的影响。在5-FU治疗下，NKD1的下调降低了肿瘤的体积和重量（图5E-G）。我们还检测了肿瘤组织切片中Ki67和Bax的表达（图5H）。在5-FU处理下，NKD1敲低降低了这两种标记物，表明NKD1在体内促进了CRC细胞对5-FU的抵抗。

6）CRC类器官中NKD1介导的5-FU耐药性的验证

结直肠癌组织分离和类器官建立的工作流程如图6A所示。复苏后7天每天观察类器官发育，免疫组织化学分析证实了干细胞标志物的表达，包括CD44、Ep-CAM和CEA。高水平的NKD1和Ki67进一步表明了强大的增殖能力（图6B-D）。类器官成熟后，进行5-FU敏感性试验。给药不同浓度，7 d后测得IC50为13.07 μg/mL（图6E）。类器官分为5组：未处理对照组、5-FU组、2个NKD1敲除+5-FU组和OE-NKD1+5-FU组。利用CellTiter-Lumi™测定法评估细胞活力（图6F）。如图6G所示，sh-NKD1慢病毒增强了类器官对5-FU的反应。

7）NKD1通过激活β-Catenin通路促进结直肠癌的进展

为了研究NKD1促进CRC发生、进展和对5-FU的抗性的机制，我们利用基因集富集分析（GSEA）分析了TCGA CRC测序数据中NKD1的富集情况。结果表明，NKD1表达升高在两条Wnt信号通路中均有富集。GEPIA数据集的线性回归分析表明，NKD1与Wnt通路的关键激活因子β-catenin、LRP6、LGR5和Axin1呈正相关，与APC、FZD1和FZD5呈负相关。此外，TMA IHC分析显示β-catenin表达水平与肿瘤T和AJCC分期相关，并与NKD1表达呈强正相关（图7A，B）。核细胞质分离进一步表明，NKD1敲低抑制β-catenin的核积累，表明转录激活受损（图7C）。Co- IP结果表明，NKD1过表达显著上调细胞中β-catenin的表达（图7D）。Western blot （WB）分析进一步证实，NKD1敲低或过表达可调节β-catenin、FZD7和APC的表达水平，而对AXIN1和DVL1无显著影响（图7E）。免疫荧光（IF）染色证实，细胞中NKD1的调节影响β-catenin和FZD7（图7F）。为了进一步确定Wnt/β-catenin通路在结直肠癌中NKD1功能中的作用，我们使用Wnt/β-catenin抑制剂iCRT3处理NKD1过表达细胞（HCT116）。我们通过细胞活力测定和集落形成实验进一步证实，iCRT3显著提高过表达NKD1-的HCT116细胞对5-Fu的敏感性（图7G，H）。Transwell实验显示，iCRT3显著降低了过表达NKD1的HCT116细胞中CRC细胞的迁移和侵袭能力（图7I）。接下来，肿瘤球形成实验表明，iCRT3显著降低了过表达NKD1的HCT116细胞的球形成能力（图7J）。同样，由于NKD1过表达而升高的β-catenin、CD44、CD133和SOX2蛋白水平也被iCRT3降低（图7K）。这些数据表明，Wnt/β-catenin信号通路在NKD1诱导的CRC干性表达增强中起关键作用，这有助于5-Fu耐药。

8）慢病毒介导的NKD1沉默抑制患者来源的异种移植模型中结直肠癌的生长

为了评估NKD1在体内CRC进展中的作用，在PDX瘤内注射慢病毒以降低NKD1的表达（图8A）。PDX#1和PDX#4的临床信息见图8B。携带NKD1特异性shRNA的慢病毒载体被注入瘤内以沉默NKD1的表达。肿瘤生长分析显示，与对照组（shNC）相比，NKD1敲低显著降低了肿瘤体积、最终肿瘤重量和平均体重（图8C-H）。肿瘤抑制的代表性图像如图8C、F所示。鉴于CRC中NKD1的致癌性与Wnt信号密切相关，我们评估了肿瘤组织中下游通路的活性。Western blot和IHC分析显示，NKD1沉默后，NKD1、β-catenin、FZD7和Ki67的表达显著降低，与肿瘤负荷减轻一致（图8I，J）。这些发现强调了NKD1作为CRC生长驱动因素的作用，并表明慢病毒介导的敲低通过体内Wnt/β-catenin轴的调节有效地损害肿瘤进展。

结论：

NKD1在结直肠癌（CRC）中表达上调，可增强5-氟尿嘧啶（5-FU）耐药性，并是临床预后的独立预测因子。从机制上看，NKD1主要通过促进APC蛋白降解和增强β-catenin的稳定性来激活经典Wnt信号通路，而涉及FZD7受体的调控可能进一步放大该通路，从而促进CRC进展及5-FU耐药。关键的是，利用PDX模型进行的体内研究证实，靶向NKD1可克服5-FU耐药。综上所述，这些发现表明NKD1是化疗耐药的关键调节因子，支持其作为预测生物标志物以及联合治疗策略中潜在治疗靶点的应用价值。

参考文献：

Dong L, Yang Z, Xu Z, Huang G, Yang X, Lv Y, Huang K, Liu Z, Zhang F, Jiang K, Yu Z. NKD1 promotes the progression and 5-FU resistance of colorectal cancer via the Wnt/β-catenin signaling. Cell Death Dis. 2026 Jul 10;17(1):861. doi: 10.1038/s41419-026-09077-2.