恶性胶质瘤干细胞分泌的外泌体诱导人单核细胞分化为M2巨噬细胞以及调控PD-L1的表达
恶性胶质瘤干细胞分泌的外泌体诱导人单核细胞分化为M2巨噬细胞以及调控PD-L1的表达
外泌体由含有嵌入蛋白和RNA的胆质层构成，其三维结构稳定。它可以保护生物活性，增强生物分布，并支持与局部或远处组织中的靶细胞的相互作用。
外泌体可以介导恶性肿瘤之间动态交流，即使存在血脑屏障的中枢神经系统和免疫系统中的游离型外泌体也有这种作用。
近日，来自美国德州大学MD安德森癌症中心的Heimberger团队在《Oncoimmunology》(IF=7.719)发表的《Glioblastoma stem cell-derived exosomes induce M2 macrophages and PD-L1 expression on human monocytes》一文中探讨了胶质母细胞瘤（GBM）来源干细胞（GSCs）分泌的外泌体（GDEs）是否可诱导免疫抑制。研究结果发现GDEs倾向于被巨噬细胞前体——单核细胞摄取。GDEs进入单核细胞的细胞质，导致肌动蛋白细胞骨架的重组，并使单核细胞朝向免疫抑制性M2表型（包括程序性死亡配体1（PD-L1）表达）极化。质谱分析表明，GDEs含有多种组分，包括信号转导和转录激活因子3（STAT3）途径的成员，其功能介导该免疫抑制转换。 Western blot分析显示GSC外泌体处理的单核细胞和GBM患者浸润的CD14 +细胞中的PD-L1的上调主要与STAT3的磷酸化增加相关，并且在一些情况下与p70S6激酶和Erk1 / 2的磷酸化相关。这些数据表明GDEs分泌的GBM释放因子，是GBM相关免疫抑制性微环境的强效调节剂。
技术路线
实验结果
1．免疫细胞群体对外泌体的摄取是可变的
图1.外泌体的特征鉴定。（A）成纤维细胞MRC5、胶质瘤细胞U87、胶质瘤干细胞GSC20和GSC267细胞外泌体的代表性直方图。（B）GSC20外泌体的透射电子显微镜图像。（C）和（D）流式细胞术分析结合到免疫磁珠的GSC20和MRC5外泌体。
图2.免疫群体对外泌体的摄取是可变的。（A）GBM患者PBMCs与PKH67标记的GSC外泌体(GSC-Exo)共培养，用流式细胞仪检测各种免疫细胞群对GSC-Exo的摄取情况；（B）GBM患者（左）和健康献血者（右）的免疫细胞群体摄取PKH-67标记的GSC20-Exo的数据。（C）用抗CD3/CD28抗体激活T细胞，用PMA和离子霉素激活NK细胞，然后将细胞与PHK67标记的GSC20外泌体孵育6小时。流式细胞仪检测被CD4+或CD8+T细胞及CD56+NK细胞摄取的外泌体。
2.GSC-Exo定位于单核细胞的细胞质中，并诱导单核细胞其肌动蛋白重组
图3.人单核细胞外泌体内化过程。（A）单核细胞摄取外泌体的动力学研究。（B）（C）PKH67标记的外泌体被单核细胞摄取的共聚焦显微镜图像。（D）用共聚焦显微镜观察单核细胞与PKH67标记的外泌体共培养48小时后Phalloidin标记的细胞结构情况。白色箭头指示肌动蛋白重组（E）外泌体孵育的单核细胞的胞质区。
3.GSC-Exo诱导单核细胞极化为M2巨噬细胞表型
图4.GSC-Exo将单核细胞极化为M2样表型。（A）用不同来源外泌体孵育的单核细胞中M1和M2标记蛋白的表达情况（左）及PD-L1（右）的平均荧光强度[MFI ]。（B）GBM患者组织中的单核细胞标志物IbA1（绿色）和PD-L1抗体（红色）染色图像。（C）外泌体孵育单核细胞后MCP-3和CXCL1的相对像素密度。
4.GSC-Exo含有EIF2、mTOR和EphrinB信号通路蛋白
图5 GSC-Exo和成纤维细胞外泌体的蛋白质组学分析。（A）GSC来源（GSC20、GSC17、GSE267）的外泌体与成纤维细胞（MRC5，WI38）外泌体差异蛋白的通路注释。（B）成纤维细胞（MRC5，WI38）外泌体和GSC外泌体差异蛋白火山图。
图6 GSC外泌体和成纤维细胞外泌体蛋白的亚细胞定位和功能分析。（A）成纤维细胞源性外泌体的蛋白质和GSC外泌体蛋白质的亚细胞定位；（B）成纤维细胞源性外泌体的蛋白质和GSC外泌体蛋白质的功能。
5. GSC外泌体诱导人单核细胞PD-L1上调，与STAT3磷酸化有关
图7外泌体孵育的人单核细胞PD-L1通路分析及GBM患者血液和肿瘤组织分离的CD14+细胞的PD-L1通路分析（A）p- STAT3、P- STAT1、P- Akt、β-actin、HSP70在成纤维细胞、GSCs、成纤维细胞和GSC衍生的外泌体表达分析。（B）用成纤维细胞和GSC衍生的外泌体处理两个供体的单核细胞中PD-L1、P- STAT3、STAT3、GAPDH的表达分析。（C）经外泌体孵育的人单核细胞中PD-L1和P- STAT3蛋白表达的密度分析。（D）PD-L1、p- STAT3、p- STAT1、p-ERK1／2、pJNK、pp70S6K和GADPH在健康对照外周血CD14+细胞、GBM患者的CD14+细胞和GBM浸润的CD14+细胞的Western分析。